Fabrication simple de colonnes capillaires ultra-haute performance en interne avec l’approche FlashPack. L’objectif de cette procédure est d’introduire un protocole optimisé pour un emballage rapide et facile de colonne capillaire ultra haute performance pour l’analyse protéomique LC-MS. La protéomique moderne est basée sur la spectrométrie de masse couplée à la chromatographie liquide capillaire ultra-haute performance.
La séparation peptidique se fait principalement dans des colonnes capillaires d’un diamètre interne de 75 micromètres. Au même niveau que les produits commerciaux, il est possible de préparer des colonnes capillaires en interne. Les colonnes préparées sur mesure présentent des qualités de séparation similaires aux analogies commerciales, tout en économisant beaucoup d’argent et en permettant la personnalisation de la taille des sorbants et des colonnes.
Nous démontrons ici une procédure d’emballage optimisée pour la fabrication interne de colonnes capillaires, que nous appelons FlashPack. L’idée derrière l’optimisation est d’emballer à partir d’une concentration de boue de sorbant très élevée, tout en utilisant la même configuration d’emballage de bombe sous pression de 100 bars. Cela nécessite une rupture continue des amas de sorbants, qui se forment autour de l’entrée de la colonne à une concentration élevée de sorbant et empêchent le nouveau matériau sorbant d’entrer dans le capillaire.
Techniquement, nous y parvenons en utilisant une barre magnétique comme marteau, en chauffant et en se déplaçant constamment autour du capillaire à l’intérieur du fil absorbant. FlashPack correctement appliqué augmente le taux d’emballage jusqu’à 10 fois. Cela le rend approprié pour emballer des sorbants ultra haute performance de taille micro metricbeat plus douce et pour fabriquer de très longues colonnes jusqu’à une longueur d’un mètre dans des délais raisonnables.
La procédure de préparation des colonnes se compose de cinq étapes. Trois étapes préparatoires, qui comprennent l’assemblage de la station d’emballage et la préparation de la boue capillaire et sorbante. Ensuite, le capillaire est d’abord emballé dans la bombe sous pression à une pression de 60 à 100 bars.
Il est suivi par la connexion du capillaire emballé au système HPLC, l’emballage du sorbant à haute pression et la coupe de colonne à la taille. La procédure FlashPack nécessite que des modifications soient apportées aux étapes trois et quatre du protocole commun. Tout d’abord, nous préparons une station d’emballage.
Il se compose d’un réservoir d’azote gazeux avec une pression de sortie d’au moins 50 bars. Le réservoir est connecté à la vanne d’aération de la bombe sous pression, qui est placée dans l’agitateur magnétique. La sortie de la vanne d’aération est insérée dans une bouteille d’eau par un capillaire ÉTROIT ID PEEK, ce qui permet un contrôle fin de la dépressurisation.
Ensuite, nous préparons un capillaire. L’emballage peut être fait soit dans un capillaire fritté avec une fritte de verre intégrée formée de Kasil et de formamide. Une autre option consiste à emballer dans un capillaire tiré préparé par un arracheur laser sutter.
Le capillaire doit être allongé de 10 à 15 centimètres par la longueur de colonne prévue. La vidéo suivante est préparée sur l’exemple d’un emballage capillaire à émetteur tiré. Protégez une extrémité d’émetteur tirée avec une pointe de pipette à chargement de gel coupé.
Pour plus de détails, voir la version texte du manuscrit. L’étape suivante est la préparation de la boue sorbante. Tout d’abord, mettez environ 50 milligrammes de sorbant sec dans un tube de centrifugeuse de 1,5 millilitre.
Ce sera un flacon de sorbant de stock. Cette vidéo a été préparée avec l’utilisation du sorbant micrométrique Reprosil Pur C18 AQ 1.9 de Dr.Maisch. Ajouter un millilitre de méthanol dans le flacon de sorbant de base.
Vortex pendant 10 secondes. Et soniquez dans un bain de sonication pendant encore 10 secondes. Laissez le sorbant bien tremper pendant 20 à 30 minutes, puis vortexez et soniquez-le une fois de plus.
Préparez un flacon de sorbant fonctionnel. Il doit s’agir d’un flacon à fond conique qui s’insère dans la bombe. Il peut s’agir d’un autre tube de centrifugeuse de 1,5 millilitre ou de tout autre flacon en fonction de la conception particulière de la bombe sous pression.
Nous utilisons un tube à bouchon à vis conique à jupe coupé à la hauteur de la bombe sous pression. Re-suspendez le sorbant dans le flacon de sorbant de stock et transférez 500 microlitres dans le flacon de sorbant de travail avec une barre magnétique de deux par trois millimètres de taille. Garnir le flacon de travail à un millilitre avec du méthanol.
Laissez le flacon de travail reposer sur la table pendant 10 minutes pour que le sorbant se dépose par gravité. Le résultat de cette étape doit être un flacon de fond conique avec la couche inférieure de sorbant lâche d’environ quatre millimètres de haut. Si la couche est trop basse, et un peu plus de sorbant du flacon de stock.
Ainsi, le flacon de travail préparé est destiné à la préparation de plusieurs colonnes sur une période de plusieurs mois. Si le flacon absorbant de travail reste sans agitation pendant plus de deux heures, il doit être tourbillonné, soniqué et déposé à nouveau par gravité avant l’emballage. Lorsque tout est préparé, passez à la quatrième étape, en emballant la bombe sous pression.
Portez toujours des lunettes de protection lorsque vous travaillez avec des capillaires de silice fondue et la bombe à pression. Dans le même temps, les gants de protection ne sont pas recommandés. Ils réduisent considérablement le sens du toucher requis pour une manipulation correcte des capillaires de petit diamètre et conduisent à des erreurs.
Placez le flacon absorbant dans la bombe à pression et fixez hermétiquement tous les nœuds. Commencez la rotation à 60 à 100 coups par minute, Insérez le capillaire émetteur fritté ou tiré dans la bombe. Poussez-le tout en bas du flacon, puis soulevez-le de deux à trois millimètres et fixez le nœud.
Appliquez la force minimale requise pour fixer le capillaire. Vérifiez que le capillaire est correctement fixé. Il doit être impossible de déplacer le capillaire en le tirant à la main.
Très lentement, ouvrez la soupape de la bombe sous pression tout en gardant l’extrémité ouverte du capillaire pointée loin de votre visage. Regardez les premières étapes du processus d’emballage. Immédiatement après la pressurisation, le sorbant remplit le capillaire et il devient non transparent sur toute la longueur.
Dès que le sorbant commence à s’emballer à l’intérieur de l’extrémité distale, la contre-pression augmente, le débit ralentit et la boue de sorbant uniforme à l’intérieur du capillaire se reforme en plusieurs paquets de sorbant, séparés par des espaces libres de sorbant. Le sorbant déjà emballé est visible comme une région densément colorée en croissance continue. Gardez les régions remplies de sorbant à au moins 70% de la longueur capillaire avec de petits espaces sans sorbant pendant toute la durée du processus d’emballage.
Il y a plusieurs problèmes courants à surveiller pendant le processus d’emballage. Ils nécessitent un ajustement de la configuration en vol pour maintenir une livraison efficace de sorbant dans le capillaire. Le problème le plus fréquent est lorsque le nouveau sorbant cesse d’entrer dans le capillaire alors que le sorbant déjà à l’intérieur continue de bouger.
Dans la plupart des cas, l’entrée capillaire est bloquée par des amas de sorbants auto-agrégeants. Appliquez ces étapes une par une jusqu’à ce que le flux de sorbant soit rétabli, puis ignorez le reste des étapes liées au problème. Augmentez la vitesse de rotation à 500 tours par minute et réduisez-la immédiatement à 60 tr/ min.
La plupart du temps, il restaure le flux de sorbant. Vérifiez que la vitesse de rotation est d’au moins 60 tr/ min pour le reste du processus d’emballage. Si cela ne vous aide pas, évasez brièvement la bombe d’emballage et pressurisez-la immédiatement.
Si cela n’aide pas, ou si le blocage se reproduit, repositionnez le capillaire à l’intérieur de la couche de sorbant. L’absence du sorbant peut être due au fait que l’extrémité ouverte capillaire est soit trop haute au-dessus de la barre magnétique, de sorte que l’extrémité de la colonne ne la touche pas. Ou le capillaire est positionné trop bas et colle dans le fond du flacon.
Tout d’abord, évaz complètement la bombe, puis desserrez l’écrou, poussez le capillaire vers le bas, puis tirez-le de deux millimètres en arrière. Fixez l’écrou. Ouvrez la vanne pour pressuriser la bombe et continuez à emballer.
Plus de détails sur les problèmes d’emballage sont décrits dans la version texte de la méthode. Continuez à emballer la colonne jusqu’à ce que la longueur de colonne cible plus cinq à sept centimètres soit atteinte. Arrêtez la rotation et dépressurisez très lentement la bombe.
Ouvrez un peu la valve de la bombe et attendez que la bulle éclate à l’intérieur de la bouteille d’eau pour s’apaiser. Ensuite, ouvrez la vanne un peu plus large et attendez à nouveau que la bulle éclate pour ralentir. Ainsi, par étapes progressives, relâchez la pression jusqu’à ce qu’aucun gaz ne sorte de la vanne.
N’ouvrez pas la vanne d’un seul coup. Cela entraînera un bouillonnement à l’intérieur du capillaire et le sorbant retournera dans le flacon. Si cela se produit, pressurisez la bombe en arrière et attendez que la colonne soit à nouveau emballée.
Lorsque le gaz cesse de sortir de la vanne d’aération, retirez le capillaire emballé de la bombe sous pression. Ne laissez pas la colonne sécher. S’il n’est pas immédiatement connecté au système HPLC pour un emballage ultérieur, mettez le capillaire emballé en stockage en le submergeant entier dans une solution d’éthanol à 10%.
Les colonnes HPLC déconnectées sont stockées de la même manière. Si aucun autre emballage n’est prévu pour aujourd’hui, retirez le flacon de sorbant de la bombe et fermez-le hermétiquement. Conservez-le pour plus loin l’emballage de la colonne.
Étape cinq, emballage HPLC. Connectez le capillaire emballé au système HPLC via une connexion HPLC. Commencez le flux de solvant organique élevé.
Ajustez le débit en fonction de la longueur emballée en ciblant environ 300 bars. Pour les capillaires emballés de 40 centimètres, utilisez le débit de 200 à 300 litres normaux par minute. Surveillez le sorbant en vrac à l’intérieur du capillaire en cours d’emballage, ce qui ajoute à la longueur totale emballée.
Sans arrêter l’écoulement, trempez le corps de la colonne deux fois dans le bain de sonication. Il est important de n’immerger qu’une partie du corps de la colonne. Ne pas immerger les extrémités de colonne et les connexions capillaires.
Lorsque le lit absorbant cesse de rétrécir, plongez le corps de la colonne dans le bain de sonication deux fois plus sans arrêter le flux. Exécutez la colonne pendant 10 minutes supplémentaires à 300 barres. Arrêtez le débit, attendez que la pression descende en dessous de trois barres et déconnectez la colonne.
Inspectez visuellement la colonne pour l’absence de trous et de décolorations. S’il y en a, la sonication sous l’écoulement peut être répétée. Pour les expériences critiques, envisagez de créer une nouvelle colonne.
Coupez la colonne à la longueur souhaitée. Une coupe bien faite est une condition préalable à l’efficacité de la colonne. Faites une encoche dans le revêtement en polyamide avec le scribe.
Fissurez partiellement le capillaire et séparez deux morceaux. Polir l’avant de la colonne sur une plaquette en céramique ou avec un film de rodage. Reconnectez la colonne au système LC à l’aide d’une connexion ultra haute pression.
Démarrez le débit de travail à 2%B. Le débit de travail est ajusté en fonction des paramètres de la colonne. Par exemple, des colonnes d’identification de 100 micromètres sont exécutées à 500 nanolitres par minute.
Attendez que la pression s’équilibre et vérifiez la contre-pression de la colonne. Une colonne bien préparée donne une contre-pression proportionnelle à sa longueur et à ses caractéristiques de sorbant. Par exemple, une colonne capillaire de 30 centimètres emballée avec deux micromètres de sorbant a une contre-pression de 450 à 500 bars à 2% de solvant B.Si la colonne produite donne une contre-pression dans la plage attendue, elle est prête à l’emploi.
Si la contre-pression est bien en dehors de la plage attendue, quelque chose ne va pas soit avec la colonne, soit avec le système LC. L’emballage avec FlashPack produit un capillaire emballé pour 50 centimètres avec un sorbant de 1,9 micromètre en moins d’une heure à une pression d’emballage de 100 bars. À titre d’exemple, nous produisons une colonne ultra haute pression ID de 30 centimètres 100 micromètres emballée dans un capillaire émetteur tiré avec un sorbant ReprosilPur C18 AQ de 1,9 micromètre.
L’emballage a été fait à 60 bars dans un capillaire émetteur tiré de 50 centimètres de long. Le capillaire a été emballé à 40 centimètres en 40 minutes avec un peu plus de sorbant à l’intérieur du capillaire non emballé. Le capillaire emballé a été connecté au système HPLC et fonctionnait à 300 nanolitres par minute avec du solvant B, qui dans notre cas était de 80% d’acétonitrile, 0,1% d’acide formique.
La longueur finale emballée était de 43 centimètres. La colonne a été coupée de 30 centimètres. À 500 nanolitres par minute de débit de travail avec 99% de solvant B, la colonne a donné la contre-pression de 275 bars, ce qui est proche de la valeur attendue.
Pour tester la colonne, nous avons séparé 50 fmol d’un digeste tryptique de la protéine cytochrome C dans un gradient de 15 minutes de 2 à 50% B. Les pics chromatographiques étaient très symétriques avec une queue minimale. La FWHM moyenne était d’environ trois secondes.
Le protocole décrit est capable de produire des colonnes UHPLC dans une configuration d’emballage commune de 100 bars dans un délai raisonnable. Les colonnes HPLC ou UPLC courtes peuvent être emballées en quelques minutes, tandis que les longues colonnes de 30 à 50 centimètres sont emballées en moins d’une heure. La méthode est efficace pour emballer des sorbants avec RP et toute autre chimie dans n’importe quel D’entrée de colonne.
Les colonnes produites sont reproductibles aussi efficaces que toute autre colonne commerciale de taille et de paramètres de sorbant similaires.
