Ce protocole fournit une méthode de paillasse pour évaluer l’efficacité et les mécanismes d’action de la thérapie thrombolytique assistée par histotripsie ou lysotripsie, une approche non invasive alternative pour traiter la thrombose veineuse profonde critique. Cette technique utilise l’activité des bulles pour avoir un effet bidirectionnel grâce à une augmentation de la fibrinolyse due à une livraison lytique améliorée et à l’hémolyse des globules rouges dans le caillot. Cette approche de paillasse pour traiter la thrombose veineuse profonde facilite la modélisation des caillots sanguins, le traitement par lysotripsie et l’imagerie simultanée pendant le traitement.
La génération de nuages de bulles, la planification du traitement et le guidage par image peuvent également être utilisés pour étudier les traitements in vitro à base d’histotripsie d’autres maladies, telles que les tumeurs rénales et hépatiques. Pour configurer la source d’histotripsie, montez la source sur un système de positionnement motorisé. Couvrez le réseau d’imagerie avec un couvercle de sonde et fixez le réseau coaxialement dans l’ouverture de la source d’histotripsie.
Connectez le réseau d’imagerie à un système de balayage par ultrasons et immergez complètement la source d’histotripsie et le réseau d’imagerie dans le réservoir. Utilisez une seringue pour éliminer doucement les bulles d’air et utilisez le réseau d’imagerie et le scanner pour acquérir des images d’eau dégazées en mode B à 20 images par seconde. Lors de l’acquisition des images, ajustez la position du réseau d’imagerie à l’intérieur de l’ouverture du transducteur confocal jusqu’à ce que le nuage de bulles soit situé approximativement au centre de la fenêtre d’image et enregistrez l’emplacement focal détecté dans la fenêtre d’imagerie.
Ensuite, arrêtez l’insonation et réglez la tension appliquée à la source d’histotripsie à zéro. Pour préparer un caillot pour l’analyse, utilisez une pince pour couper l’extrémité scellée d’une pipette contenant un caillot et laissez le caillot et le sérum glisser dans une boîte de Pétri. Utilisez un scalpel pour couper le caillot à une longueur d’un centimètre et utilisez une lingette nettoyante pour éponger doucement la section coupée afin d’éliminer tout excès de liquide.
Utilisez une pince à épilez pour placer soigneusement la section de caillot sur une balance et enregistrer le poids. Ensuite, soulevez manuellement le canal d’écoulement d’un réservoir d’eau à osmose inverse dégazé et retirez le récipient modèle du canal. Utilisez une pince à épileuse pour placer soigneusement le caillot dans le récipient modèle sans endommager le caillot et attacher le récipient au canal d’écoulement.
Abaissez le canal d’écoulement dans le réservoir de sorte que l’extrémité proximale de l’étage par rapport au réservoir soit basse par rapport au côté distal et utilisez une pipette pour ajouter 30 microlitres de plasma réchauffé de 37 degrés Celsius au réservoir. Surveillez la température du réservoir d’eau jusqu’à ce qu’il atteigne au moins 36 degrés Celsius et utilisez une pipette pour ajouter 80,4 microgrammes de rt-PA dans le réservoir de plasma. Pour amorcer le canal d’écoulement, utilisez une pompe à seringue pour aspirer le plasma du réservoir dans le canal jusqu’à ce que le récipient modèle ait été rempli.
Ensuite, nivelez manuellement le modèle de récipient pour vous assurer qu’aucune bulle d’air n’est présente dans le récipient modèle, comme on le voit dans la fenêtre d’imagerie. Pour planifier un chemin pour la source d’histotripsie et le réseau d’imagerie pour une exposition uniforme à l’histotripsie le long de la longueur du caillot, utilisez le script d’imagerie pour utiliser les positionneurs motorisés afin d’aligner le réseau d’imagerie parallèlement à la longueur du caillot et de confirmer qu’aucune bulle d’air n’est présente dans le vaisseau. Utilisez les positionneurs motorisés pour aligner le réseau d’imagerie de manière à ce que le plan d’imagerie soit parallèle à la section transversale du caillot.
En utilisant la fenêtre d’imagerie comme guide, déplacez la source d’histotripsie à l’extrémité proximale du caillot, par rapport au réservoir. Pour déterminer le chemin d’insonation le long de la longueur du caillot, définissez des points de cheminement le long de la longueur du caillot par incréments de cinq millimètres. Avant de finaliser chaque waypoint, les impulsions d’essai au feu proviennent de la source d’histotripsie avec les mêmes paramètres d’insonation que ceux démontrés, mais avec l’exposition globale réduite à 10 impulsions totales.
À chaque waypoint, enregistrez les positions du moteur à l’aide des commandes désignées par le fabricant. Pour traiter le caillot sur toute sa longueur en fonction du trajet défini à l’étape de prétraitement, réglez la pompe à seringue à 0,65 millilitre par minute et attendez que le ménisque du plasma bouge. Interpolez le chemin de traitement avec des étapes intermédiaires entre les points de cheminement établis avec une taille de pas fixe et utilisez les positionneurs pour déplacer la source d’histotripsie à chaque emplacement de chemin, en utilisant les paramètres d’insonation définis à l’origine.
Ensuite, créez un script pour configurer le réseau d’imagerie afin d’acquérir une image en mode B du caillot et du vaisseau modèle quelques secondes avant l’application de l’impulsion d’histotripsie à chaque emplacement. Appliquez ensuite l’impulsion d’histotripsie à chaque waypoint, en acquérant les émissions acoustiques dans le script pour former des images de cavitation passive après l’analyse. Utilisez la fenêtre d’imagerie pour imager l’activité de la bulle pendant l’application de l’impulsion d’histotripsie à chaque emplacement de chemin.
Après l’analyse, soulevez manuellement le récipient modèle hors du réservoir d’eau pour drainer le perfusate par gravité et utilisez la pompe à seringue pour extraire la solution plasmatique du canal d’écoulement afin de permettre la collecte de l’ensemble du perfusate dans un petit bécher. Débranchez le récipient modèle et retirez le caillot. Ensuite, essuyez le caillot avec des tissus de laboratoire et pesez le caillot pour évaluer la perte de masse du caillot.
Lors de l’application d’une tension suffisante à la source d’histotripsie, un nuage de bulles est généré dans la région focale du transducteur et visualisé par imagerie ultrasonore. La position focale est définie comme le centre du nuage de bulles. Ce perfusate témoin d’un caillot exposé au plasma seul, et ce perfusate d’un caillot traité par lysotripsie ont été utilisés pour évaluer la teneur en hémoglobine et en D-dimère comme démontré.
La variabilité de la concentration d’hémoglobine peut être quantifiée par absorption optique. Ici, un caillot peut être visualisé dans un vaisseau modèle via l’imagerie en mode B avant l’exposition à l’histotripsie afin de déterminer la position du caillot pour la segmentation de l’image de cavitation passive. Comme le confirme cette image de cavitation passive co-enregistrée avec l’image en mode B du caillot, l’énergie acoustique est contenue principalement dans le caillot pendant l’exposition à l’histotripsie.
Dans les échantillons exposés à l’histotripsie, la perturbation est principalement limitée au centre du caillot, ce qui correspond aux emplacements observés de l’activité des bulles suivis par imagerie par cavitation passive. Avec l’ajout de lytique, la perte de masse se produit également dans les régions plus proches de la périphérie du caillot. Alternativement, des liposomes écogéniques contenant de la rt-PA peuvent être utilisés à la place de l’administration systémique de rt-PA pour permettre l’évaluation de l’administration ciblée de médicaments au caillot.
La lysotripsie offre une approche alternative non invasive au traitement de nombreuses maladies. Ce protocole in vitro permet d’évaluer l’efficacité du traitement et son succès potentiel dans l’application in vivo.
