Il s’agit d’un protocole de cristallisation conçu pour optimiser la croissance d’un cristal protéique tout en dérivant simultanément la protéine avec une molécule progressive pour déterminer la structure d’une protéine par cristallographie aux rayons X. Pour déterminer la structure cristalline des rayons X d’une protéine complètement nouvelle, les conditions de cristallisation sont optimisées pour produire des cristaux de qualité. Dans le cas d’une protéine complètement nouvelle, des atomes lourds doivent être introduits dans le cristal pour produire un cristal dérivatisé.
Les données de diffraction des rayons X sont recueillies à partir du cristal dérivatisé et doivent être résolues par calcul pour produire une structure cristalline à rayons X. La cristallisation et la dérivation sont deux processus laborieux. Pour remédier à ces goulets d’étranglement, nous avons mis au point une procédure de dépistage optimisée qui atteint simultanément ces deux objectifs.
Ce protocole utilise une technique précédemment développée connue sous le nom de criblage aléatoire de matrice de microsérage. Les cristaux ou le précipité cristallin sont broyés en microsé-oeds qui peuvent être utilisés pour commencer la croissance du cristal dans des conditions complètement indépendantes. Dans le même temps, nous introduisons une molécule progressive appelée I3C dans l’état de cristallisation.
Cette molécule fournit un grand signal anormal qui permet à la structure d’être résolue par une seule longueur d’onde anormaux discussion progressive. Pour les utilisateurs peu familiers avec le dimensionnement expérimental des structures cristallines, nous présentons un pipeline logiciel convivial pour automatiser partiellement la solution de structure en l’adaptant pour utiliser le signal anormal d’I3C. La première étape consiste à créer un stock I3C.
Mesurez 120 milligrammes d’I3C dans un tube de microcentrifugeuse. Ajouter 200 microlitres de deux hydroxyde de lithium molaire au tube de microcentrifugeuse. Le chauffage du tube à 40 à 60 degrés et le vortex peuvent être utilisés pour encourager la dissolution.
Le seul stock molaire de solution lithium I3C doit être brun. Deux méthodes peuvent être utilisées pour introduire l’I3C dans le stock de protéines. Lithium I3C peut être ajouté directement au stock de protéines.
3,75 microlitres à 30 microlitres d’I3C peuvent être ajoutés à 150 microlitres de protéines pour donner une concentration entre cinq et 14 millimolaires. Certaines protéines peuvent se précipiter au contact de fortes concentrations d’I3C. Dans ces cas, le lithium I3C peut être ajouté à un tampon de dilution des protéines qui est tampon correspondait à la protéine échantillon à une concentration finale entre 10 à 80 millimolar.
Ajouter 150 microlitres du tampon de dilution des protéines à 150 microlitres d’échantillon de protéines. Une sonde en verre pour écraser les cristaux est faite à partir d’une pipette pasteur en verre. Avec un brûleur Bunsen sur la flamme bleue, chauffer la pipette Pasteur vers le milieu.
À l’aide d’une pince à épiler, tirez les extrémités de la pipette Pasteur dans un diamètre mince de moins de 0,3 millimètre. Maintenez ce segment dans la flamme pour séparer la pipette à ce stade et autour de l’extrémité de la pipette pour terminer la sonde de verre. C’est un exemple de la façon dont la pipette en verre devrait ressembler.
Les écrasements de cristal peuvent également être commandés auprès de fournisseurs tiers comme une alternative à la fabrication de votre propre stock de microseed A est généré par l’écrasement de cristaux de protéines ou de précipité cristallin. Placer cinq tubes de microcentrifugeuse de 1,5 mL sur la glace. Sous un microscope léger, sélectionnez les meilleurs cristaux de morphologie ou précipité cristallin qui peuvent être sacrifiés.
Pour 96 plateaux de cristallisation bien ouvrir le puits en coupant le ruban d’étanchéité en plastique. Pour les bacs suspendus, le bordereau de couvercle peut être enlevé à l’aide d’une pince à épiler et inversé sur une surface plane. Transférer 70 microlitres de solution de réservoir à l’un des tubes de microcentrifugeuse et réfrigérer sur la glace.
Vers les tubes restants, transférez 90 microlitres de solution de réservoir et retournez à la glace pour refroidir. Si le volume insuffisant du réservoir est présent réservoir de cristallisation peut être faite en mélangeant les reagents appropriés et peut être utilisé à la place. Agiter les cristaux dans la chute de cristallisation à l’aide de la sonde de verre bien l’écraser.
Les progrès peuvent être surveillés au microscope jusqu’à ce qu’aucun cristal ou matériau cristallin ne soit visible. Transférer tout le liquide de la goutte au tube de microcentrifugeuse contenant 70 microlitres de solution de réservoir. Mélanger en pipetant de haut en bas.
Transférer deux à trois microlitres de mélange au puits et rincer le puits en faisant monter et descendre. Transférer le mélange dans le tube de microcentrifugeuse. Cette étape de rinçage doit être répétée une fois de plus.
Le tube de microcentrifugeuse doit être maintenu au froid à partir de ce point vers l’avant pour éviter de faire fondre les microseeds. Vortex le tube à vitesse maximale à quatre degrés pendant environ trois minutes refroidissant le tube sur la glace régulièrement pour éviter la surchauffe. faire une dilutions périodiques sur 10 du stock de semences en transférant séquentiellement 10 microlitres entre les solutions de réservoir réfrigérées.
Entre les dilutions du stock de graines, le tube doit être vortexé. Les stocks de semences qui ne seront pas immédiatement utilisés doivent être conservés dans un congélateur ultra froid de moins 80 degrés. Un écran matricielle à microseed bien aléatoire peut être installé à l’aide d’un robot de distribution liquide.
Placez le stock de graines, la solution de stock de protéines complétée par l’I3C et l’écran de cristallisation dans le robot. À l’aide du robot, transférer 75 microlitres de l’écran de cristallisation vers le plateau de 96 puits. Ajouter un microlitre à la goutte de cristallisation et 74 microlitres au réservoir.
Transférer un microlitre de protéines complété par l’I3C à la goutte de cristallisation. Transférer 0,1 microlitre de bouillon de graines à la goutte de cristallisation. Sceller la plaque à l’aide de ruban adhésif.
Des écrans de chute suspendus peuvent être mis en place dans 24 bacs de cristallisation de chute bien suspendus. Graisser les bords des puits suspendus. Transférer 500 microlitres de solution de cristallisation vers le réservoir.
Près du centre d’une glissière de couverture en verre placer une goutte d’un microlitre de solution de cristallisation. À cette goutte, ajouter un microlitre de protéines complétée par du lithium I3C et 0,1 microlitre de bouillon de graines. Inversez la glissière du couvercle et scellez bien la cristallisation en poussant la glissière du couvercle dans la graisse.
Les bacs suspendus de chute et d’étanchéité sont incubés à une température constante pour permettre aux cristaux de se former. Ils doivent être inspectés régulièrement au microscope pour la croissance des cristaux. Une fois que les données de diffraction ont été obtenues, intégrées et mises à l’échelle comme expliqué dans le protocole écrit accompagné, le pipeline automatisé de détermination de la structure cristalline Auto-Rickshaw peut être utilisé pour résoudre le problème de phase et modéliser la protéine.
À la page de destination Auto-Rickshaw, cliquez sur le bouton procéder. Entrez votre e-mail institutionnel dans le formulaire Web Auto-Rickshaw et cliquez sur procéder à l’exécution auto-pousse-pousse. Pour les protéines sans modèle de moto homologie exécuter le protocole SAD de Auto-Rickshaw en mode avancé.
Entrez les paramètres requis. Sélectionnez la protéine comme type de molécule. Entrez la longueur d’onde de collecte de données dans angstroms.
Donc, comme moi comme élément de sous-structure pour indiquer les atomes d’iode ont été utilisés. Sélectionnez le type de sous-structure I3C pour indiquer que l’I3C était la molécule qui s’est progressivement mise en œur. Sélectionnez sub_direct méthode de détermination de la sous-structure.
Sélectionnez trois comme nombre de sous-structures prévues par monomère. Entrez-en un comme seuil de réservation de la recherche de sous-structure. Cela permet à Auto-Rickshaw de déterminer automatiquement une coupure de résolution appropriée.
Entrez le nombre de résidus dans un seul monomère, le groupe spatial de l’ensemble de données et le nombre de molécules dans l’unité asymétrique en fonction du coefficient de Matthews. Sélectionnez le niveau de diffusion approprié des données radiographiques qui conviennent à vos besoins. Entrez les données anormales sous la forme d’un fichier vide.
Entrez votre séquence protéique sous forme de fichier SEQ, PIR ou TXT. Entrez votre adresse e-mail institutionnelle. Les résultats vous sont livrés via un lien Web envoyé à l’adresse e-mail fournie.
Si Auto-Rickshaw ne parvient pas à résoudre la structure à l’aide de sa sous-structure déterminée validant la sous-structure pourrait aider à résoudre la solution de structure de dépannage. Téléchargez la liste des sites d’atomes lourds à partir de la page de résultats Auto-Rickshaw. Il s’agit d’un hyperlien appelé sites d’atome lourd.
Cela permettra de télécharger un fichier texte avec les sites d’atomes lourds. Modifiez l’extension de fichier du fichier de txt à pdb. Ouvrez le fichier pdb dans Coot.
Activez la symétrie pour voir tous les atomes lourds des unités asymétriques voisines. Mesurer les distances entre les atomes lourds, y compris à travers les unités asymétriques. I3C apparaîtra comme un triangle équilatéral avec une longueur latérale de six angstroms.
La présence d’un triangle avec ces dimensions indique que les emplacements de ces atomes lourds sont corrects. Si la sous-structure auto-pousse-pousse est incorrecte, d’autres paramètres auto-pousse-pousse peuvent être testés comme discuté dans le protocole écrit. La méthode I3C RMMS a été testée sur deux protéines, le lysozyme blanc d’œuf de poule utilisant l’écran HT de Hampton Research et le domaine de la protéine de lysine Orf11 du bactériophage P68.
Des écrans pleins ont été mis en place pour chaque protéine correspondant à l’écran de contrôle sans I3C ou microséc, écran avec microseed ajouté, écran avec I3C, et enfin l’écran avec I3C et microseed. L’ajout d’I3C à un écran en cristal ne semble pas augmenter le nombre de coups de cristallisation. Avec le lysozyme blanc d’œuf de poule, le nombre de conditions est passé de 31 à 26.
Avec le domaine Orf11, une seule condition de coup a été trouvée dans l’écran de contrôle. L’ajout d’I3C à l’écran a également donné un seul coup dans les mêmes conditions. L’ajout de microsémés au puits a entraîné une augmentation significative du nombre de conditions de frappe, ce qui a entraîné une augmentation de 2,1 et six fois pour le lysozyme de blanc d’œuf de poule et le domaine Orf11 respectivement.
Ce résultat est compatible avec d’autres études testant RMMS. Plus important encore, l’ajout d’I3C et de microsémors à un écran a également augmenté le nombre de conditions de frappe par rapport à l’écran de contrôle démontrant une augmentation de 2,3 et sept fois pour le lysozyme blanc d’œuf de poule et le domaine Orf11 respectivement. Cela démontre que la méthode I3C RMMS peut produire efficacement de nouvelles conditions pour les cristaux dérivés.
Les cristaux de ces conditions pourraient être récoltés et utilisés pour résoudre la structure cristalline. La structure du domaine orf11 du blanc d’œuf de poule pourrait être résolue avec l’élimination progressive du TAS sur le pipeline Auto-Rickshaw, en utilisant le signal anormal d’I3C démontrant une dérivation réussie par l’écran I3C RMMS. Nous avons présenté un protocole simple et efficace pour produire des cristaux de haute qualité dérivés de la molécule d’élimination progressive I3C.
Il minimise le nombre d’écrans et les étapes de manipulation cristalline, et est donc d’un intérêt particulier pour les biologistes structurels qui étudient de nouvelles protéines. Nous recommandons fortement d’optimiser la taille des cristaux en testant différentes dilutions des stocks de semences qui ont été faites pendant la préparation des stocks de semences. Et cette étape est terminée après que les écrans initiaux ont été faits.
I3C est largement disponible et il est peu coûteux à acheter et donc nous croyons que cette méthode est à la portée de la plupart des laboratoires de biologie structurelle.
