L’objectif global de cette procédure est de fournir une méthode pratique pour la préparation de composés photocaged avec des propriétés supplémentaires telles que la solubilité de l’eau ou la capacité de ciblage cellulaire. En utilisant une procédure synthétique simple, cette technique peut être utilisée pour étendre le laboratoire sur les composés en cage et pour fabriquer des composés en cage avec des propriétés supplémentaires sans compromettre leur photosensibilité. Cette synthèse peut être effectuée dans un laboratoire standard car nos composés en cage cliquables sont stables à la photo-irradiation lorsqu’ils sont dissous dans des solvants organiques non nucléophiles tels que le dichlorométhane ou le sulfoxyde de diméthyle.
Akinobu Suzuki, post-doc, Hanami Aoki et Rei Watahiki, étudiants diplômés du laboratoire, feront la démonstration de la procédure avec Hirona Sasaki. Commencez par ajouter 709,6 milligrammes de méthanol paBhc et 397,6 milligrammes de n-carbonyldiimidazole dans un flacon rond de 30 millilitres. Ajouter six millilitres secs de dichloromethane au flacon et remuer la solution à température ambiante pendant une heure.
À la fin de l’incubation, ajouter 342,8 milligrammes de 4-Dimethylaminopyridine et 552 microlitres de carbamate hexyle à six acides aminés tert-butyle, et remuer la solution à température ambiante pendant trois heures supplémentaires. Ensuite, utilisez un évaporateur rotatif sous vide pour enlever le solvant et d’autres matériaux volatils, et utilisez la chromatographie de la colonne flash gel silice pour purifier directement les résidus. Pour installer une unité fonctionnelle dans le composé cliquable de cage, dissoudre 249 milligrammes de cuivre deux pentahydrate de sulfate dans 10 millilitres d’eau échangée par ion pour donner une solution de sulfate de cuivre molaire de 0,1.
Dissoudre huit milligrammes de deux paclitaxel simulacre de paBhc premier, 7,5 milligrammes de tris (3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine, 162,4 milligrammes de sodium-l-ascorbate, et 3,1 milligrammes de 15-chloro-3, 6, 9-trioxypentyldecyl azide dans un solvant mélangé de 2,5 millilitres de 0,1 tampon de phosphate molaire et 0,5 millilitres de sulfure de diméthyle. Ensuite, ajouter 81,2 microlitres de 0,1 solution molaire de sulfate de cuivre au mélange de réaction et remuer le mélange à température ambiante pendant 80 minutes, en surveillant l’évolution de la réaction avec HPLC. À la fin de la réaction, résoudre les précipités avec 3,5 millilitres d’une solution d’eau nitryl 75% acétyl et appliquer la solution résultante directement sur le système semi-preparatif HPLC pour purifier le produit désiré.
Pour les mesures d’efficacité quantique, sous les lampes fluorescentes recouvertes de filtre coupé par la lumière UV, diluer la solution de stock d’échantillon dans 10 microlitres de sulfure de diméthyle avec 10 millilitres de tampon KMOPS. Transférer un aliquot de la solution dans le même tube à essai utilisé dans la réaction photo de l’actinomètre chimique. Irradier la solution de l’échantillon avec 350 nanomètres de lumière pendant cinq secondes, en enlevant 50 aliquots microlitres de la solution irradiée périodiquement pour analyse par HPLC.
Déterminez ensuite le temps d’irradiation en quelques secondes au cours duquel 90 % du matériau de démarrage a réagi en raccordant des parcelles de la disparition dépendante du temps du matériau de départ. Pour le ciblage ligand HaloTag d’un composé en cage cliquable, récoltez la population cellulaire cible d’intérêt avec un réaccente de dissociation cellulaire appropriée et suspendez les cellules dans 2,5 fois 10 à la cinquième cellule par millilitre de concentration de DMEM. Puis ensemencer environ 10 à la cinquième cellule par plat en plats de fond en verre de 35 millilitres pour une incubation d’une nuit à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.
Le lendemain matin, diluer 14 microgrammes de l’ADN PC trois halo épidermique facteur de croissance récepteur de l’ADN plasmatique dans un tube de centrifugeuse micro 1,5 millilitre contenant 700 microlitres de milieu de sérum réduit. Ensuite, ajoutez cinq microlitres du réaccélément lipofection dans 150 microlitres de sérum moyen réduit à chacun des quatre tubes et laissez les tubes se tenir à température ambiante pendant cinq minutes. À la fin de l’incubation, ajouter 150 microlitres d’ADN plasmatique dilué à chacun des échantillons dilués de réaccés de lipofection et incuber les échantillons à température ambiante pendant cinq minutes supplémentaires.
À la fin de l’incubation, rincer les cellules avec deux millilitres de PBS par plat et ajouter 1,5 millilitres de sérum réduit moyen à chaque culture. Ajouter 150 microlitres du complexe plasmide de reagent lipofection à chaque plat et retourner les cellules à l’incubateur de culture cellulaire pendant 48 heures. À la fin de l’incubation, aspirer les supernatants et ajouter un millilitre de DMEM fraîchement préparé complété par deux micromolaires paBhc hex fitzi halo à chaque plat.
Après 30 minutes à 37 degrés Celsius, aspirer le milieu contenant le composé en cage et rincer les cellules deux fois avec un millilitre de PBS plus pour éliminer les composés non liés. Ajouter 500 microlitres de sérum réduit moyen à chaque plat et retourner les cellules à l’incubateur de culture cellulaire pendant encore 30 minutes pour enlever les composés qui sont entrés dans les cellules. À la fin de l’incubation, rincer les cellules deux fois avec un millilitre de PBS plus par plat et ajouter un millilitre de milieu sans rouge phénol à chaque culture.
Enregistrez ensuite les images de florescence par microscopie de florescence confoccale à balayage laser. Pour la modulation photo-médiatisée de la localisation de kinase utilisant un composé en cage cliquable, graine approximativement cinq fois 10 à la cinquième cellules DE TOC-A-un dans deux millilitres du milieu F12 de Ham par plat inférieur en verre de 35 millilitres. Le lendemain, transfect les cellules avec le codage plasmide pour GFP diacylglycérol kinase gamma pendant 48 heures comme vient de le démontrer.
Après la fin de la transfection, remplacer le supernatant transfection par deux millilitres de sérum moyen réduit. Ajouter 20 microlitres de solution de travail 100 fois paBhcAA aux cellules pour une incubation de cinq à 60 minutes à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. À la fin de l’incubation, placez le plat au stade objectif d’un microscope fluorescent inversé équipé d’un double illuminateur de fluorescence à source lumineuse.
Imagez les cellules toutes les 10 secondes pendant 10 minutes tout en irradiant les cellules aux points de temps expérimentaux appropriés et aux longueurs d’onde selon le protocole expérimental. En utilisant cette méthode comme démontré, les composés en cage cliquables de certaines molécules biologiquement intéressantes, y compris le paclitaxel et l’acide arachidonique, peuvent être synthétisés avec succès. Des propriétés supplémentaires telles que la solubilité de l’eau et la capacité de ciblage cellulaire peuvent être introduites dans le paclitaxel simulé paBhc via le cuivre une réaction catalysée clic de cyclisation.
Ces paclitaxels en cage cliquables peuvent ensuite être photolysés pour produire leurs composés parentaux lors de l’irradiation à 350 nanomètres. Les propriétés physiques et photochimiques des composés en cage cliquables sont résumées dans le tableau. Dans les expériences sur les cellules vivantes, le ciblage du halo de paBhc hex fitzi vers les cellules mammifères de culture exprimant transitoirement un récepteur halotagged de protéine et de facteur de croissance épidermique induit un signal de florescence verte du halo hex fitzi de fluorescéine moiety PAHBHC sur la membrane cellulaire.
En outre, le traitement des cellules CHO-K1 exprimant transitoirement GFP diacyl glycerol kinase gamma avec de l’acide arachidonique provoque la modulation de la localisation subcellulaire de diacyl glycerol kinase gamma. Des changements similaires dans la localisation gamma de kinase de diacyl glycerol sont également observés dans les cellules traitées de paBhc-AA après exposition de lumière UV. Lors de l’exécution des expériences de caaging dans des solutions aqueous augmentant le milieu de culture, assurez-vous de toujours travailler sous la lampe fluorescente avec le filtre plafonné de longueur d’onde courte.
Après cette procédure, vous pouvez étudier les composés en cage qui ont été abondants pour une utilisation dans des expériences biologiques en raison d’un manque de solubilité de l’eau, la perméabilité de la membrane ou la capacité de ciblage cellulaire.
