L’objectif global de cette procédure est d’étiqueter les vaisseaux sanguins dans le cerveau et l’hypophyse des poissons teleost, et nous utilisons la perfusion cardiaque avec un fixatif contenant DiI dans l’espèce modèle medaka. Ainsi, cette technique qui est simple et efficace aidera à répondre à des questions importantes concernant l’anatomie vasculaire dans le cerveau et l’hypophyse des poissons teleost ainsi que la relation entre les neurones ou les cellules endocrines et les vaisseaux sanguins. Certains avantages de cette technique incluent une préparation simple et rapide, et son adaptabilité aux espèces de poissons teleost.
Pour préparer un support de poisson, couper un morceau de polystyrène à une longueur de cinq centimètres, une largeur de trois centimètres, et une épaisseur de deux centimètres, et coller le polystyrène à un plat en plastique de neuf centimètres de diamètre. Ensuite, utilisez un scalpel pour faire un trou en forme de bateau de trois centimètres dans le polystyrène. Pour préparer le système de perfusion, ajouter une canule en plastique de 30 à 50 centimètres de long à l’extrémité de l’aiguille du système de perfusion.
Pour préparer des pipettes en verre de cinq centimètres, utilisez un tire-pipette pour étirer les capillaires de verre individuels selon les instructions du fabricant. Avant de commencer la dissection, chargez une seringue de 10 millilitres avec la solution dii-fixative préparée et placez une aiguille avec une canule à l’extrémité de la seringue. Ensuite, utilisez plusieurs morceaux de ruban adhésif placés dans différentes orientations pour fixer la seringue sur le banc, et ajuster la position du microscope et du siège pour obtenir une bonne position pour la dissection et pour appuyer sur le piston de seringue avec le coude.
Ensuite, placez un poisson euthanasié dans le côté abdomen du porte-poisson vers le haut et fixez la tête et la queue avec des épingles. Utilisez des ciseaux pour couper horizontalement la couche superficielle de la peau pour ouvrir l’abdomen antérieur, et utilisez des forceps pour enlever la peau au-dessus du cœur jusqu’à ce qu’un accès clair au ventricule et à l’artériosus bulbus soit atteint. Ajouter un tuyau de verre à l’extrémité du capillaire et casser le bout de la pipette.
Apportez le tuyau de verre près du ventricule et ajoutez la pression du coude au piston de seringue pour forcer le liquide à sortir tout en épinglant le ventricule cardiaque avec la pipette. Puis perforer immédiatement le venosus sinus avec des forceps pour libérer le sang de la circulation. À partir du ventricule, ajustez l’angle de la pipette en verre pour localiser l’entrée de l’artériosus bulbus, et déplacez l’ouverture de la pipette à l’intérieur du bulbus arteriosus.
Ajoutez ensuite de la pression à la seringue pendant 30 à 60 secondes supplémentaires tout en gardant la pipette à l’intérieur du bulbus artériosus. Pour l’étiquetage optimal de tous les vaisseaux sanguins, il est essentiel de perfuser dans l’artériosus bulbus assez longtemps pour remplacer tout le sang par la solution dii-fixative. Après environ 60 secondes de perfusion, quand aucune fuite de sang n’est observée, retirez la pipette en verre et les aiguilles du poisson, et récoltez le cerveau et l’hypophyse dans le paraformaldéhyde frais de 4% pendant deux heures à température ambiante dans l’obscurité.
Rincez ensuite les tissus deux fois dans du PBS frais pendant 10 minutes par lavage avant de préparer les échantillons pour l’imagerie. Après l’injection cardiaque d’une solution fixative contenant dii comme démontré, les vaisseaux sanguins étiquetés peuvent être observés sur des tranches de tissu par microscopie stéréo fluorescente ou sur le tissu entier par microscopie confoccale. Notez que si la solution est injectée dans le ventricule cardiaque au lieu de l’artériosus bulbus ou si la solution est injectée avec une pression trop basse et /ou pendant une période trop courte, un étiquetage inadéquat des vaisseaux sera observé.
En outre, lors de l’imagerie du même tissu avec les mêmes paramètres d’imagerie, une diminution de l’intensité de l’étiquetage peut être observée après plusieurs jours, avec le signal apparaissant plus étalé dans l’échantillon de tissu. Les tranches de tissu provenant de lignées transgéniques dans lesquelles les cellules d’intérêt expriment des protéines fluorescentes peuvent être étiquetées pour des protéines d’intérêt spécifiques à l’aide de protocoles standard d’immunofluorescence permettant d’étude des interactions entre les vaisseaux sanguins et d’autres types de cellules. Il est important d’atteindre le bulbus artériosus.
Lorsque cela est réalisé, l’ajout de pression au piston de seringue devrait induire une expansion du bulbe confirmant une procédure réussie. Cette technique peut être utilisée pour étudier l’interaction entre les cellules endocriniennes et les vaisseaux sanguins dans l’hypophyse du télésol en général, mais peut-être plus spécifiquement pour étudier les différences ou les similitudes possibles entre les systèmes portails dans le téléost et les mammifères. Parce que cette utilisation politique toxiques et volatiles composés précautions telles que l’utilisation d’un masque à gaz et une salle ventilée doit toujours être prise lors de l’exécution de ces procédures.
