Il est difficile de moduler l’expression des gènes dans les îlots humains, aussi un plus grand déclin des îlots humains fonctionnels posent des défis majeurs après la modulation de l’expression des gènes. En combinant le lentivirus médié transduction SHR8 et la formation d’îlots humains appropriés. Ce protocole permet une downregulation efficace d’un gène ciblé tout en préservant la fonction des îlots pendant la culture prolongée.
Pour commencer, faites pivoter doucement la bouteille d’expédition pour garder les îlots en suspension. Transférer le milieu d’expédition contenant des îlots dans un tube de centrifugeuse conique de 50 millilitres. Laissez le tube reposer dans une armoire de sécurité biologique pendant 15 minutes afin que les îlots se déposent au fond du tube.
Retirer délicatement le milieu d’expédition à l’aide d’une pipette capillaire sans déranger la pastille de l’îlot. Suspendre à nouveau la pastille d’îlot dans le milieu CMRL avec 1% d’albumine de sérum humain à une concentration de 400 islet équivalent par millilitre. Transférez les îlots dans un plat traité par culture non tissulaire et culturez-les à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone de 5 % pendant la nuit.
Après la culture de nuit, transférer les îlots humains dans un tube de centrifugeuse conique de 15 millilitres, centrifugeuse à 250 fois g pendant cinq minutes dans un rotor balançant seau. Et aspirer le milieu avec une pipette capillaire sans déranger la pastille de l’îlot. Laver la pastille mon ajout de 10 millilitres de PBS au tube, mélanger doucement et centrifugeuse à 250 fois g pendant cinq minutes.
Après centrifugation, aspirer PBS sans déranger la pastille de l’îlot. Suspendre à nouveau la pastille en 0,5 millilitres d’un mélange d’enzymes protéolytiques et collagènes préchauffées. Pipette cinq fois à l’aide d’une pipette P1000 pour mélanger les îlots.
Incuber à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Après l’incubation, mélanger la pipette en caressant de haut en bas doucement. Vérifiez s’il y a une seule nébulosité cellulaire et le nombre de flocons ou d’îlots non digérés.
Placer une passoire de 40 microns dans une boîte de Pétri de 35 millimètres et mouiller la passoire en ajoutant un millilitre de milieu CMRL avec un sérum bovin fœtal inactivé à 10 % de chaleur et déprimant avec un piston à seringues d’un millilitre. Transférer toute la suspension cellulaire sur le dessus de la passoire. Et recueillir le passage à travers dans un tube frais de 15 millilitres.
Lavez le tube utilisé pour la digestion des îlots avec 0,5 millilitres de milieu CMRL frais pour recueillir les restes de cellules et passer le lavage à travers la passoire. Mélanger le passage dans un tube de 15 millilitres. Répétez une fois.
Pour dissocier les îlots non digérés qui restent sur la passoire, appuyez sur la passoire à l’effet d’un piston à seringues d’un millilitre. Recueillir le passage à nouveau et laver la passoire avec frais plaine CMRL 1066 milieu pour enlever tous les îlots digérés restants de la passoire et le plat. Ajouter le passage dans le tube de 15 millilitres.
Enregistrez le volume total de la suspension cellulaire et prenez un aliquot de 10 microlitres de cellules pour compter le numéro de cellule sur un hémocytomètre. Après avoir centrifugé la suspension cellulaire pendant cinq minutes à 200 fois g, retirer le milieu sans déranger la pastille. Pour produire des pseudo-îlots à l’aide d’une plaque de fixation 96 puits ultra faible, calculez d’abord le volume total des cellules nécessaires une fois 10 à la cinquième par millilitre de la suspension à cellule unique.
Ensuite, suspendre à nouveau la pastille d’îlot dans le milieu CMRL avec 10% de chaleur inactivée sérum bovin fœtal de sorte que 30 microlitres de la suspension cellulaire a 3000 cellules. Ensuite, transférez le volume requis de la suspension à cellule unique dans un tube frais de 15 millilitres. À 250 unités de transduction par cellule d’un lentivirus contenant de l’ARN SH ciblant un gène d’intérêt ou un contrôle.
Pour mélanger la suspension cellulaire avec le virus, pipette doucement cinq fois avec une pipette P1000. Transférez ensuite les cellules mélangées dans un réservoir stérile de reagent de 50 millilitres si vous utilisez une pipette à huit canaux. À l’aide d’une pipette à huit canaux ou d’une pipette P200, distribuez 30 microlitres par puits de suspension cellulaire mélangés à du lentivirus dans chaque puits.
Ensuite, centrifuger la plaque de puits 96 dans une centrifugeuse de plaque baquet balançante à 270 fois g à température ambiante pendant sept minutes. Culture à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié de dioxyde de carbone de 5% pendant la nuit. Après l’incubation, retirer la plaque de puits 96 de l’incubateur et la placer dans l’armoire de sécurité biologique.
Pipette 100 microlitres par îlot de 10% de haut FBSCMRL dans un puits pour empêcher le séchage des îlots et continuer à la culture pendant une semaine. Pipette 100 microlitres par puits de milieu CMRL avec 10% de sérum bovin fœtal inactivé de chaleur du réservoir aux pseudo-îlots et pipette de haut en bas deux à trois fois doucement dans le puits pour soulever les îlots vers le haut. Ensuite, aspirez le milieu dans le puits contenant un pseudo-îlot et éjectez-le dans une boîte de Pétri de 10 centimètres.
Vérifiez la plaque au microscope léger pour vous assurer de l’enlèvement complet de tous les pseudo-îlots et procédez à des expériences en aval. Pour produire des pseudo-îlots à l’aide d’une plaque de culture de puits de puits de 24 puits, ajoutez d’abord 500 microlitres par puits d’une solution de rinçage anti-adhérence. Centrifugeuse à 1300 fois g pendant cinq minutes dans une centrifugeuse de plaque de seau balançante.
Ensuite, observez la plaque au microscope pour vous assurer que les bulles d’air sont retirées des micro-puits. Dans un cabinet de sécurité biologique, aspirer la solution de rinçage anti-adhérence des puits. Rincez chaque puits avec deux millilitres de CMRL chaud uni 1066 moyen une fois.
Ensuite, aspirez le milieu carré cmrl 1066 et ajoutez 0,5 millilitre par puits de CMRL chaud avec 10% de sérum bovin fœtal inactivé à chaque bien planifié pour une utilisation. Déterminer le nombre total de cellules nécessaires pour chaque puits. Suspendre à nouveau les cellules individuelles dans 0,8 millilitres de milieu CMRL avec un sérum bovin fœtal inactivé à 10 % dans un tube stérile de 1,5 millilitre.
Pour créer un puits de pseudo-îlot transduit par un lentivirus, ajoutez 125 unités de transduction par cellule à la suspension à cellule unique en maintenant le volume du virus en dessous de 0,2 millilitres. Incuber le mélange cellulaire et le mélange de virus à 37 degrés Celsius avec mélange doux occasionnel pendant une heure pour permettre le contact des cellules avec le virus avant la condensation des cellules. Après une heure, ajuster le volume total du mélange de cellules d’îlots et de virus à un millilitre en ajoutant le milieu CMRL avec 10 % de sérum bovin fœtal inactivé à chaleur.
Si les cellules forment des touffes après une incubation d’une heure se dispersent en une seule suspension cellulaire par pipetting doux et rapide deux à trois fois. Transférer la suspension cellulaire dans un puits de la plaque de culture de 24 puits de micro-puits. Immédiatement après le pipetage, centrifugeuse à 100 fois g à température ambiante pendant trois minutes pour capturer les cellules dans tous les micro-puits.
Observez au microscope pour vérifier que les cellules sont réparties uniformément dans tous les micro-puits. Il est essentiel de centrifuger la plaque de micro-puits immédiatement après avoir ajouté le puits mélangeant la suspension à cellule unique de l’îlot dans les puits. Les changements séquentiels dans la morphologie des pseudo-îlots de 3000 cellules humaines d’îlot créées dans une plaque d’attachement 96 puits ultra bas ont montré des touffes monolayer ou lâches de cellules transformées en agrégats solides avec une bordure ronde lisse en une semaine.
En revanche, dans une plaque de culture micro-puits, la formation de cellules et de pseudo-îlots à partir de seulement 500 cellules d’îlots est généralement visible dans les quatre jours. La taille uniforme des pseudo-îlots réduit la variation au sein d’un groupe d’essai et permet l’incubation statique en utilisant aussi peu que cinq pseudo-îlots par mesure. L’essai de fusion de Perry pour la réponse d’insuline a montré que les pseudo-îlots humains ont maintenu la sécrétion robuste d’insuline de première phase en réponse au glucose après sept jours de culture.
L’introduction du lentivirus ciblant la lipase adipeuse adipeuse humaine ou perilipin cinq gènes en une seule suspension cellulaire assure la transduction efficace et homogène des cellules des îlots et permet une downregulation très efficace des gènes. Il est important de se rappeler que le temps nécessaire pour disperser l’îlot humain en cellules individuelles est affecté par de nombreux facteurs tels que: la taille, la distribution et la caractéristique du donneur. Il est donc important d’accorder une attention particulière à la disparition des îlots humains pendant la digestion.
Tout au long du protocole, il est important de manipuler la suspension à cellule unique doucement pour éviter la perte de cellules. Les pseudo-îlots humains créés peuvent être utilisés pour de nombreuses applications afin de déterminer l’effet de la modulation des gènes tels que : la tache occidentale, l’étude histologique et les mesures des taux de consommation d’oxygène. Ce protocole permet d’évaluer le faible teneur en gènes ciblés dans la régulation de la santé des îlots et la fonction dans les îlots humains en utilisant des produits de laboratoire communs et des techniques simples.
L’utilisation d’îlots humains peut nécessiter l’approbation préalable d’une commission d’examen locale. Veuillez consulter le comité d’examen local avant le début de l’étude. Le lentivirus est classé comme biosécurité niveau deux.
Contactez le comité de biosécurité avant le début de l’utilisation du lentivirus.
