L’objectif de cette méthode est d’identifier la connectivité fonctionnelle des entrées à longue portée provenant de régions éloignées du cerveau à l’aide de photostimulation en tranches de cerveau. Le ciblage stéréotaxique d’une région spécifique du cerveau pour diverses expressions médiatisées de canaux iion sensibles à la lumière permet la stimulation sélective des axones provenant de cette région avec de la lumière. Louis Richevaux, doctorant de mon groupe, démontrera la procédure.
Avant la chirurgie, vérifiez que l’animal est bien anesthésié avec une pincée d’un outeil. Retirez doucement sa langue pour faciliter la respiration. Ensuite, rasez les cheveux crâniens.
Injecter 20 microlitres d’hydrochlorure de lidocaïne sous la peau de la tête pour une anesthésie locale et attendre cinq minutes. Pour exposer le crâne, faire une coupure sur le cuir chevelu. Ensuite, placez l’animal dans un cadre stéréotaxique.
Insérez les barres d’oreille et reposez-les sur les os légèrement rostral aux oreilles et tirez vers le bas la peau pour créer un bon accès au crâne. Serrez les barreaux d’oreille et installez le morceau de nez. Maintenez le corps de l’animal horizontalement et au niveau de la tête à l’aide d’un support ajusté en hauteur.
Placez un coussin chauffant sous l’animal pour le maintenir à la température physiologique. Nettoyez ensuite le crâne en appliquant du chlorure de sodium à 0,9 % à l’l’intérieur d’un coton-tige pour enlever les tissus mous. Ajustez le crâne de sorte que l’accès bregma lambda soit nivelé.
Ensuite, localisez le site d’injection sur le crâne selon les coordonnées postérieures et médiale et placez l’aiguille d’injection au-dessus. Marquez le crâne avec une aiguille jetable. Par la suite, déplacez l’aiguille d’injection vers le haut de quatre centimètres.
À l’aide d’une bavure de 0,5 millimètre, créer une craniotomie d’un millimètre de diamètre sur la marque à la moitié de la vitesse maximale. Écouvillonner avec un tissu en cas de saignement. Ensuite, videz l’eau contenue dans la seringue Hamilton pour l’entreposer en l’éjectant complètement à l’l’insurgée à l’l’huile.
Seule l’aiguille est remplie d’eau. Décongelez la solution virale à injecter sur la glace, puis retirez-la brièvement de la glace et obtenez 700 nanolitres de la solution à l’aide d’une micropipette. Ensuite, déposez une goutte sur un morceau de film de paraffine.
Placez le film de paraffine sur la craniotomie. Plongez l’aiguille dans la goutte de solution virale sans changer la position antéroposteriore et latérale. Ensuite, utilisez la fonction de retrait de la pompe pour remplir la seringue d’environ 500 nanolitres de la solution virale sur le film de paraffine.
Effectuez cette procédure sous le stéréoscope, observez la chute disparaître et assurez-vous de ne pas aspirer d’air. Assurez-vous que la seringue a été bien remplie. Testez le système d’éjection en descendant le piston pour tester éjecter une petite goutte de liquide.
Par la suite, insérez l’aiguille dans le cerveau à la profondeur choisie. Appuyez sur le bouton d’exécuter pour l’injection. Puis, retirez lentement l’aiguille sur trois à cinq minutes.
Lavez immédiatement l’aiguille dans de l’eau distillée propre en la vidant plusieurs fois afin d’éviter de l’obstruer. Ensuite, retirez l’animal du cadre stéréotaxique. Suture de la peau et faire trois ou quatre points attachés avec 2-1-1 noeuds chirurgicaux standard.
Pour extraire le cerveau, faire une coupe sur la peau du cou au nez, puis sectionner les dernières vertèbres du crâne avec des ciseaux. Rétractez la peau et coupez le crâne le long de la ligne médiane de la direction caudale à la direction rostrale. Retirer délicatement l’os pariétal et la partie caudale de l’os frontal.
Extraire le cerveau avec une petite spatule arrondie en l’insérant entre le cerveau et le plancher crânien, sectionnant le bulbe olfactif, le nerf optique, et d’autres nerfs crâniens et cervelet. Submergez doucement le cerveau dans la solution de coupe à froid de glace. Par la suite, transférez le cerveau dans un papier filtre et séchez doucement la surface corticale.
Collez le cortex cérébral au porte-spécimen d’un vibratome avec le côté caudal face à la lame afin de couper les tranches horizontales du cerveau. Ensuite, remplissez la chambre de coupe avec une solution de coupe oxygénée glacée afin que le cerveau soit complètement immergé. Section 300 micromètres d’épaisseur tranches avec le vibratome à une vitesse de 07 millimètres par seconde à une amplitude millimétrique.
À ce stade, il est recommandé de vérifier brièvement l’expression Chronos-GFP dans le thalamus à l’aide d’une lampe de poche fluorescente et de lunettes de filtre correspondantes. Pour effectuer l’enregistrement patch-clamp à cellules entières, transférez doucement une tranche de cerveau contenant le complexe hippocampal à la chambre d’enregistrement. Perfusez continuellement la chambre d’enregistrement avec 34 degrés Celsius ACSF bouillonné avec du carbogen à deux à trois millilitres par minute.
Examinez brièvement l’expression Chronos-GFP dans les terminaux d’axon dans la région d’intérêt avec l’éclairage LED bleu au grossissement 4X. Passer à un objectif d’immersion 63X et ajuster la mise au point. Vérifiez s’il y a des axones exprimant Chronos-GFP et choisissez un neurone pyramidal pour l’enregistrement des patchs.
Ensuite, remplissez une pipette avec une solution interne à base de gluconate de potassium. Montez-le dans le porte-pipette sur la scène de la tête. Patchez la cellule dans la configuration de pince de tension.
Approchez le neurone identifié et appuyez délicatement sur la pointe pipette sur le soma. La pression positive devrait produire une fossette à la surface de la membrane. Ensuite, relâchez la pression pour créer un joint gigoOm.
Une fois scellée, réglez la tension de détention à moins 65 millivolts. Briser la membrane avec une impulsion aiguë de pression négative. Enregistrez les réponses du neurone aux étapes actuelles hyperpolarisantes et dépolarisantes en mode pince à courant à cellules entières.
Enregistrement dans les réponses postsynap de pince de courant ou de tension à la stimulation de champ entier de LED de 475 nanomètres des fibres afferent exprimant Chronos. Stimuler avec des trains de dix stimulations de deux millisecondes à 20 hertz. L’activité des neurones présubicular dans la couche trois en réponse aux étapes actuelles hyperpolarisantes et dépolarisantes a été enregistrée dans la configuration de patch-clamp de cellule entière.
Les terminaux d’axon d’ADN stimulants exprimant Chronos-GFP ont suscité des potentiels post-synaptiques excitatifs dans la couche présubicular trois cellules principales dans le mode courant de pince. Selon l’intensité lumineuse, les EPSP pourraient atteindre le seuil potentiel d’action. Des réponses post-synaptiques ont également été observées en mode pince de tension, car des courants post-synaptiques excitatifs ont été obtenus.
On y voit une couche de trois neurones pyramidaux entourée d’axones thalamiques exprimant Chronos-GFP dans des couches superficielles présubicular avec coloration DAPI photographiée avec un microscope d’épifluorescence. Et cette image a été prise à un grossissement plus élevé avec un microscope confocal. Un nivellement attentif du bregma le long de l’axe dans l’exécution d’expériences pilotes avec un traceur fluorescent est crucial pour améliorer la précision de l’injection stéréotaxique.
Cette procédure peut également être utilisée pour étudier les projections convergentes de différentes zones en injectant à deux stades génératifs sensibles à deux longueurs d’onde différentes. Le développement de cette technique a permis une analyse anatomique et fonctionnelle précise des circuits entre des régions cérébrales éloignées d’une manière spécifique au type de cellule.
