En utilisant cette méthode, nous pouvons directement passer en examen la formation de tube cardiaque, en boucle, et la formation de chambre pleine sans autres manipulations expérimentales de l’embryon de souris. Bien que, nous utilisons MLC-2v-tdTomato souris comme un exemple, cette méthode simple peut être largement utilisé avec d’autres lignes fluorescentes de souris reporter. Le principal avantage de ce protocole est qu’il est très simple et ne nécessite pas de techniques ou d’équipements complexes.
Il peut être effectué en laboratoire régulier. Après l’accouplement femelle avec des souris mâles, à la fois MLC-2v-tdTomato 8 à 10 semaines, vérifier les mères pour les bouchons vaginaux tous les matins. Déposer les mères enceintes, euthanasiées à différents jours après le coït, en position supinée et pulvériser l’abdomen avec 70% d’éthanol.
Utilisez des ciseaux chirurgicaux pointus et des forceps pour ouvrir la cavité abdominale par incision de la peau et de la paroi abdominale. Après avoir localisé les cornes utérine bilatérales dans la partie dorsale de la cavité abdominale, séparez l’utérus entier à l’aide de ciseaux chirurgicaux pointus et de forceps pour couper soigneusement au-dessus des oviductes des deux côtés. Placer l’utérus entier disséqué dans une boîte de Pétri de 10 centimètres avec du PBS glacé.
À l’aide de ciseaux chirurgicaux tranchants et de forceps, séparez soigneusement chaque sac amniotique le long de la corne utérine. Utilisez des pinces à épiler pour transférer chaque embryon dans une plaque de culture de 35 millimètres remplie de PBS glacé. À l’aide de ciseaux et de forceps chirurgicaux tranchants, ouvrez un sac amniotique et exposez chaque embryon en coupant le cordon ombilical, puis coupez autant que possible les tissus embryonnaires supplémentaires sans endommager les embryons.
Sous un microscope disséquant avec un illuminateur de microscope à fibres optiques, coupez la tête de l’embryon et transférez-la dans un tube de 1,5 millilitre avec 100 microlitres de tampon A pour que le génotypage ultérieur soit corrélé avec les résultats de l’imagerie épifluorescente. À l’aide de forceps fins, ouvrir la poitrine de l’embryon. Avec des ciseaux chirurgicaux pointus et des forceps, retirez le cœur des poumons et de la vascularisation.
Utilisez des pinces à épiler pour transférer le cœur embryonnaire disséqué dans une plaque de culture de 35 millimètres avec PBS. Placez la plaque avec des cœurs embryonnaires de souris sous un microscope à disséquer épifluorescent. Utilisez des forceps fins pour positionner les cœurs embryonnaires de sorte que les ventricules en développement sont confrontés à l’examinateur.
Ajustez la mise au point à l’aide d’un objectif de 0,63 x en mode champ lumineux. Prenez des expositions en champ lumineux et capturez plusieurs images. Pour visualiser l’expression tdTomato, éteignez un illuminateur de microscope à fibres optiques et réglez le filtre pour la fluorescence rouge.
Réajustez la mise au point de l’image si nécessaire, ajustez la luminosité et le contraste, prenez des expositions rouge-fluorescentes et capturez plusieurs images. Pour le génotypage embryonnaire, faire bouillir des échantillons de tête précédemment isolés dans le tampon A à 100 degrés Celsius pendant 30 minutes. Centrifugeuse pendant deux minutes à 11, 360 fois G.Transfert 20 microlitres de supernatant dans un nouveau tube de 1,5 millilitre avec 20 microlitres de tampon B et mélanger.
Utilisez 4,5 microlitres du supernatant mixte comme modèle d’ADN et combinez-le avec 0,5 microlitres de chacun des 10 amorces avant et inversées spécifiques aux micromolaires, 10 microlitres de polymése préméxée 2x et tampon de réaction, puis ajoutez de l’eau à un volume total de 20 microlitres. Exécutez un PCR tel que décrit dans le manuscrit. Chargez la réaction terminée dans une échelle d’ADN de paire de base de 1% sur un gel d’agarose de 1% et courez à 140 volts dans le tampon 1x TAE pendant 25 minutes.
Placez le gel complété sur un transilluminateur UV et allumez la lumière UV pour identifier les bandes d’ADN. MLC-2v est considéré comme le marqueur le plus tôt pour la spécification ventriculaire de chambre pendant le développement de coeur. Chez les souris knock-in de journaliste de MLC-2v-tdTomato, l’expression relativement faible de tdTomato dans le tube linéaire de coeur à E8.0 devient plus forte à E8.5 comme montré utilisant la formation image épiflourescente de montage entier des embryons.
Utilisant l’imagerie épiflourescente de montage entier du coeur disséqué, la formation ventriculaire de chambre pendant le développement de coeur de souris peut être facilement déterminée. Dans le coeur disséqué d’un embryon entier de souris à E10.5, l’expression de journaliste de MLC-2v-tdTomato a été montrée dans la partie ventriculaire du coeur et pas dans le secteur d’entrée, le tractus de sortie, ou les futurs atria. Chez E12.5 à E13.5, le journaliste tdTomato s’exprime exclusivement dans les ventricules du cœur à quatre chambres.
Le modèle d’expression ventriculaire-spécifique semblable a été montré dans l’embryon disséqué de souris à E16.5. Après l’imagerie entière, le génotype des embryons a été déterminé à l’aide de deux ensembles d’amorce pour le génotypage PCR, confirmant les embryons homozygotes porteurs de l’allèle knock-in tdTomato, des hétérozygotes et des embryons de type sauvage. Cette méthode est assez simple et simple à exécuter.
L’étape critique consiste à disséquer les cœurs embryonnaires. Comprendre l’anatomie cardiaque pendant le développement cardiaque est nécessaire pour isoler avec succès le cœur de l’embryon entier.
