Ce protocole démontre une nouvelle procédure d’immunofluorescence séquentielle et d’immunohistochimie sur les cryosections des embroys de poisson zèbre à un stade précoce, qui permet des analyses précises de co-localisation dans des populations cellulaires spécifiques. Le principal avantage de ce protocole est sa flexibilité. Il combine l’immunofluorescence et les techniques d’immunohistochimie à l’aide d’une seule cryosection pour maximiser la morphologie tissulaire, la co-localisation de l’expression et la compatibilité des anticorps.
Ce protocole pourrait être appliqué à d’autres poissons ou modèles amphibies, car ces chercheurs sont souvent confrontés à des complications similaires avec la disponibilité des anticorps et effectuent souvent des types similaires d’expériences. Travailler avec des cryosections embryonnaires à un stade précoce peut être délicat car ils sont petits et cryosectioning peut être difficile, mais la préparation avancée et la pratique aidera à soulager toutes les luttes dans cette méthode. Il y a plusieurs étapes dans notre protocole qui nécessitent une manipulation et des soins particuliers et qui peuvent être difficiles à maîtriser sans voir quelqu’un démontrer les techniques.
Pour commencer, transférez les embryons de poisson zèbre chimérique fixes et préparés quarante-huit heures après la fécondation à partir d’un tube avec un mélange de 15 25 OCT à un moule en plastique à l’aide de forceps minimisant tout transfert du mélange. Remplissez le moule environ la moitié avec oct moyen et mélanger doucement les embryons en elle. Préparez des moules en plastique étiquetés et transférez les embryons désirés dans les moules en plastique étiquetés vides, minimisant ainsi le report du milieu oct.
Puis remplir délicatement avec le milieu OCT au sommet des moules avec des embryons. Travaillant sous un microscope stéréo léger pour la visualisation, utilisez des aiguilles pour organiser les embryons dans l’orientation désirée. Placez ensuite les moules préparés dans un récipient isolé avec une plate-forme métallique et congelez-les sur de la glace sèche.
Placez doucement un seau à glace sur la plate-forme métallique pour créer une chambre froide et congeler pendant environ 30 minutes. À l’aide d’un cryostat fixé à moins 20 degrés Celsius, couper les embryons incorporés en cryosections épaisses de 10 à 12 micromètres tout en vérifiant périodiquement la profondeur de la section au microscope pour surveiller l’emplacement et les tissus. Placez les sections sur des glissières en verre chargées et séchez-les à température ambiante pendant la nuit.
Lavez les glissières trois fois pendant cinq minutes dans 1X PBS dans un récipient approprié. Déposer les glissières sur une surface plane dans une chambre humide. Utilisez un stylo barrière pour décrire les sections pour garder le liquide sur les glissières.
Pipette 200 microlitres de tampon de bloc par section et incuber dans le tampon de bloc pendant deux heures à température ambiante. Préparer la dilution primaire des anticorps et bloquer le tampon et bien mélanger par pipetting. Inclinez doucement les glissières pour égoutter le tampon de bloc et retourner à la chambre humide.
Pipette 200 microlitres de solution d’anticorps primaires par section sur les glissières et 200 microlitres de tampon de bloc sur les sections appropriées comme commande. Incuber les glissières à quatre degrés Celsius pendant la nuit dans une chambre humide remplie d’eau déionisée en s’assurant de sceller les bords de la chambre pour aider à retenir l’humidité. Lavez les glissières trois fois pendant cinq minutes dans 1X PBS et dans un récipient approprié.
Préparer la dilution secondaire des anticorps pendant le lavage et bloquer le tampon et bien mélanger par pipetting. Après avoir posé les glissières sur une surface plane dans une chambre humide, ajouter 200 microlitres de solution d’anticorps secondaire par section. Incuber les glissières dans une solution d’anticorps secondaire à température ambiante dans l’obscurité pendant 30 minutes.
Lavez les glissières trois fois pendant cinq minutes dans 1X PBS dans un récipient approprié. Après avoir placé les glissières sur une surface plane, ajouter la solution de coloration nucléaire sur chaque section et incuber couvert pendant 10 minutes. Après avoir drainé la solution de coloration nucléaire, montez les glissières avec des supports fluorescents non durcissants et un glissement de couverture en verre.
S’assurer de les garder dans l’obscurité à quatre degrés Celsius jusqu’à l’imagerie. Placez les glissières dans des contenants individuels avec 1X PBS et rangez-les à plat à quatre degrés Celsius pendant la nuit, tout en vous agitant doucement pour desserrer suffisamment le couvercle pour qu’ils se détachent lorsqu’ils sont agités. Assurez-vous de ne pas appuyer sur le bordereau de couverture ou de tenter d’enlever le bordereau de couvercle manuellement, mais attendez qu’ils se retirent avec un minimum de mouvement forcé.
Une fois les feuillets de couvercle enlevés, transférez doucement les glissières dans un récipient avec du 1X PBS frais. Retirez le 1X PBS et incubez les diapositives en salin à trois zones tamponnées 1X avec 0,1 % d’un surfactant non ionique trois fois pendant cinq minutes à température ambiante. Incuber les diapositives dans une solution de peroxyde d’hydrogène à 3% à température ambiante pendant 15 minutes.
Ensuite, déposez la glissière à plat et ajoutez la chute tampon bloc sage à la surface. Inclinez doucement les glissières pour égoutter le tampon de bloc. Séchez la zone autour des sections et placez les glissières à plat dans une chambre humide.
Ajouter 200 microlitres de solution d’anticorps primaires par section sur les toboggans et incuber dans une chambre humide à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Inclinez doucement les glissières pour égoutter la solution d’anticorps primaire et lavez-les deux fois pendant cinq minutes en 1X TBST. Appliquez ensuite des arrière-plan prêts à l’emploi, réduisant la baisse du reagent de blocage à chaque section, et incubez dans une chambre humide à température ambiante pendant 20 minutes.
Inclinez doucement les glissières pour égoutter le tampon de bloc. Séchez soigneusement la zone autour des sections et placez les glissières à plat dans une chambre humide. Appliquez une solution d’anticorps secondaire prête à l’emploi à chaque goutte de section sage et incuber dans la chambre humide à température ambiante pendant 30 minutes.
Inclinez doucement les glissières pour égoutter la solution secondaire d’anticorps et lavez-les deux fois pendant cinq minutes en 1X TBST. Après séchage de la zone autour des sections, placez les glissières sur une surface plane et ajoutez 200 microlitres du substrat chromogénique HRP à chaque section. Démarrez une minuterie lorsque le substrat a été appliqué sur la première diapositive et incubez à température ambiante pendant trois minutes.
Égoutter la solution de substrat. Rincez brièvement les glissières dans un récipient approprié avec 1X PBS et lavez-les à l’eau déionisée deux fois pendant cinq minutes avec une légère agitation. Contre-tacher les glissières en les plaçant dans une solution de coloration à l’hématoxyline jusqu’à 30 secondes et laver trois fois pendant cinq minutes chacune dans de l’eau déionisée.
Incuber les glissières dans un récipient contenant de l’eau du robinet scott pendant une minute, puis laver à nouveau trois fois pendant cinq minutes dans de l’eau déionisée. Déshydrater les diapositives à travers une série de teneurs en éthanol diluées dans de l’eau déionisée et du xylène dans une hotte chimique. Après avoir enlevé les diapositives du xylène immédiatement ajouter le milieu de montage à base de toluène et placer un bordereau de couverture.
Pour assurer le succès pendant le glissement de couverture, il est important de travailler d’un côté de la glissière à l’autre tout en abaissant lentement le glissement de couverture pour empêcher des bulles qui obscurciraient le tissu. Enfin, visualisez et visualisez les diapositives à l’aide d’un microscope à lumière composée et d’un appareil photo numérique au grossissement 100X. Anticorps spécifiques utilisés ici pour détecter simultanément la prolifération des cellules et des cellules donneuses identifiées et quantifiées cellules donneuses qui prolifèrent activement.
Après l’immunofluorescence et l’immunohistochimie, il est essentiel de générer des images de haute qualité afin d’identifier avec précision les cellules individuelles. Un programme d’analyse d’image a été utilisé pour effectuer la superposition d’images. Lors de la tentative de cette procédure, il est plus important de bien tacher et contrer les glissements de tache pendant l’immunohistochimie.
Après cette procédure, d’autres méthodes peuvent être effectuées en tant que modifications au protocole original, telles que l’utilisation de différentes combinaisons d’anticorps, types de tissus ou espèces. Les images peuvent également être analysées de diverses façons pour obtenir des données pertinentes. Cette technique nous a permis d’examiner la co-localisation et les antécédents génétiques multiples comme un moyen d’étudier les interactions cellule à cellule et pourrait être appliquée de la même manière à d’autres techniques nécessitant une analyse détaillée de la co-localisation.
Bon nombre des réhagents de l’immunohistochimie sont dangereux et doivent être traités en conséquence. Le travail avec l’éthanol, le xylène et la rigidité de montage doit être effectué dans le capot. Les déchets de DAB doivent être éliminés car les déchets dangereux et les lavages post-DAB doivent être blanchis.
