Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine inflammatoire de la biodisease au sujet de la colite ulcéreuse et de la maladie de Crohn. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être utilisée pour évaluer les premiers effets anti et proinfammatoires des protéines de signalisation. L’implication de cette technique prolonge l’étude du gaz dans de nouvelles avancées et l’inflammation.
Bien que cette méthode peut fournir un aperçu de l’effet génétique sur l’inflammation intestinale. Il peut également être appliqué à d’autres facteurs tels que les régimes alimentaires et le microbiome. En général, les personnes nouvelles à ce semestre auront du mal parce que le traitement des tissus cicatriciels de la maladie est délicat.
La démonstration visuelle de cette méthode est critique car la dissection et les étapes de préparation de tissu sont difficiles à apprendre parce que mystalia et les structures de tissu cellulaire peuvent être modifiées. Pour induire le sodium de sulfate de dextran, ou colite de DDS, remplacez l’eau potable régulière par la solution de 3%DSS, ajoutez le libidium pendant sept jours. Mesurer le poids corporel de chaque souris, la consommation de solutions DSS et la production quotidienne de selles.
À la fin du traitement de sept jours, placez la souris dans la position supine et utilisez de petits ciseaux pour faire une incision médiane de trois centimètres de long dans l’abdomen. Récoltez la rate et mesurez sa taille. Ensuite, utilisez des forceps pour soulever le côlon pour lui permettre d’être séparé de la mesenterie environnante.
Et extraire le côlon entier jusqu’à ce que le cecum et le rectum soient visibles. Transecter le tissu à la marge colonosque. Et profondément dans le bassin pour libérer le côlon proximal et distal, respectivement.
Mesurer et enregistrer la longueur du côlon isolé. Et utilisez une seringue de 10 millilitres équipée d’une aiguille de gavage pour rincer le côlon avec 10 millilitres de PBS glacé pour enlever les excréments et le sang jusqu’à ce que l’illuate s’éclaircisse. Pour l’identification histologique, divisez les échantillons de tissu en sections proximales, moyennes et distales de taille égale.
Et fixer les tissus en 4%paraformaldéhyde pendant la nuit à 4 degrés Celsius. Pour l’hématoxyline et la coloration de l’éosine du tissu du côlon isolé, le lendemain matin, submergez les morceaux de tissu dans 30% saccharose et PBS pendant la nuit dans des tubes individuels de 15 millilitres pour la protection cryo des échantillons. Le lendemain, intégrer les tissus dans une température optimale de coupe ou composé OCT.
Et refroidir les tissus en moins 20 degrés Celsius jusqu’à ce que l’OCT durcit. Placez les blocs OCT dans le cryostat et réglez le cadran d’épaisseur à 12 micromètres. Tranchez et recueillez ensuite 12 sections gelées épaisses de micromètre sur des glissières de microscope en verre.
Lorsque tous les tissus ont été sectionnés, réchauffer les toboggans à 65 degrés Celsius sur une plaque chaude pendant 20 minutes. Et laver brièvement les sections chauffées dans de l’eau distillée avant de les souiner avec une solution de coloration à l’hématoxyline pendant cinq minutes. Retirer l’excès de solution d’hématoxyline et courir dans l’eau du robinet pendant cinq minutes.
Et différencier les sections avec 0,5% d’acide chlorhydrique dans l’éthanol pendant 30 secondes, suivie d’un rinçage d’une minute sous l’eau courante du robinet. Ensuite, lavez les échantillons pendant une minute dans PBS. Suivi d’un autre lavage de cinq minutes sous l’eau courante du robinet.
À la fin du lavage, submerger les tissus dans une série ascendante d’éthanol pendant 10 secondes par immersion. Suivi d’une contre-tache dans l’éosine pendant deux minutes. Pour la déshydratation des échantillons, submergez les glissières dans 95 % d’éthanol et deux changements de 100 % d’éthanol pendant cinq minutes par immersion.
Suivi d’une compensation avec deux changements de cinq minutes en xylène. Ensuite, marquer les lésions tissulaires aux colons proximaux, moyens et distals de chaque groupe expérimental. Pour l’analyse immunohistochimique, après avoir réchauffé les sections pendant 20 minutes sur la plaque chauffante, lavez les glissières trois fois en PBS pendant 10 minutes par lavage.
Et éliminer la peroxyde endogène avec une incubation de peroxyde d’hydrogène de 10 minutes 3%. À la fin de l’incubation, lavez les échantillons trois fois dans PBS comme démontré et bloquez toute liaison non spécifique avec tampon de blocage pendant au moins une heure à température ambiante. Ensuite, remplacez le tampon de blocage par le cocktail d’anticorps primaire d’intérêt.
Pour une incubation d’une nuit à 4 degrés Celsius. Le lendemain matin, aspirez la solution d’anticorps primaire excédentaire et lavez les glissières trois fois dans PBS. Après le dernier lavage, incuber les toboggans avec le cocktail d’anticorps secondaire biotinylé approprié.
Suivi de l’étiquetage avec streptavidin horseradish peroxidase complexe à température ambiante. Pour visualiser les cellules immunoréactives, étiquetez les échantillons avec DAB jusqu’à ce qu’une couleur brun clair ou foncé se développe. Et contrestain les sections avec de l’hématoxyline et de l’ammoniac dilué à 0,3%.
Lorsque les glissières ont séché, utilisez un microscope léger pour obtenir des images de champ lumineux des sections tissulaires sous un grossissement de 10 x. Et utiliser un programme de traitement d’image pour identifier et quantifier la population des cellules immunitaires marquées à la fois dans l’épithélium et le propria lamina. Pour l’analyse de l’expression génétique dans les colons traités par le DSS, extraire l’ARN de moins 80 degrés Celsius a décongelé des échantillons de tissus du côlon selon les protocoles standard d’extraction de l’ARN.
Et mélanger un microgramme avec l’ARN total avec 2,5 microlitres de 20 millimolaire oligo deoxythymidine 12 à 18 amorces et un microlitre de moloney murine virus inverse transcriptase. Après une incubation de 60 minutes à 42 degrés Celsius, mélanger un microlitre de l’ADNC avec 0,5 % de microlitres des amorces PCR quantitatives appropriées et inversées pour les cytokines d’intérêt et le colorant vert fluorescent 2x. Exécutez ensuite le PCR quantitatif sous les paramètres appropriés et calculez l’expression relative du gène selon les protocoles standard.
Comparées aux souris de wildtype, les souris de KO d’alpha gustducin montrent une colite plus grave avec la perte excessive de poids, la diarrhée et le saignement intestinal. Après sept jours de l’administration de DSS, l’analyse histologique des sections de deux points révèlent des dommages plus aggravés de tissu dans les colons proximaux, moyens, et distal des souris de KO, comparées à leurs pendants de wildtype. Cette activation immunitaire excessive conduit à l’induction de la colite avec une infiltration robuste de diverses cellules inflammatoires dans le côlon animal à élimination directe comme observé par l’analyse immunohistochimique.
En outre, l’analyse quantitative de PCR démontre des niveaux plus élevés de TNF alpha et d’expression gamma d’inférence mais expression inférieure d’IL-5, 10, et 13, dans ko comparé aux colons de souris de wildtype sans différence dans TGF bêta une expression observée. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler d’optimiser la dose textoreuse de sodium southvater et la durée de démonstration. Transmettre cette procédure, d’autres méthodes comme l’obtention de la culture peuvent être effectuées afin de comprendre des questions supplémentaires comme l’effet de l’inflammation dans l’origine des tissus intestinaux.
Après son développement, cette technique ouvre la voie à des chercheurs dans le domaine de l’inflammation intestinale pour explorer les contributions des mutations génétiques à la gravité des érosions de biodisease et d’autres vertébrés. N’oubliez pas que travailler avec les tissus intestinaux de la maladie et son contenu peut être extrêmement dangereux et les répercussions telles que le port de choses qui sont appropriées, la protection personnelle permanente doit toujours être prise lors de l’exécution de cette procédure.
