Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la signalisation cellulaire telles que l’importance de différents domaines protéiques dans l’interaction des enzymes réceptifs et l’activation enzymatique. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet des tests concomitants des interactions enzymatiques des récepteurs et les conséquences fonctionnelles de cette interaction sur l’activité enzymatique. Pour chaque plaque, utiliser 10 millilitres de DMEM complétés par 10%FBS et 1% de pénicilline et de streptocotomycine.
La veille de la transfection, les cellules embryonnaires embryonnaires de semence 293-T en plaques de 12 10 centimètres à l’aide d’un hémocytomètre pour compter les cellules. Incuber à 37 degrés Celsius en 5%C02. Une fois que les cellules sont 80 à 90% confluent, utilisez un agent de transfection à base de lipides pour transfecter cinq des plaques.
Effectuez la transfection en suivant les instructions du fabricant pour les cellules d’adhérence dans des plaques de 10 centimètres. Puis transfect un deuxième ensemble identique de cinq plaques avec une plaque supplémentaire servant de contrôle non transmis pour la mesure de la quantité de protéines exprimées avant l’immunoprécipitation. Incuber les plaques transfectées dans un incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius en 5% de CO2 pendant 48 heures.
Utilisez un microscope fluorescent pour examiner les cellules pour l’expression GFP et s’assurer que la transfection a eu lieu avec succès. Mélanger 15 microlitres d’orthovanadate de sodium de 100 millimifères avec 50 microlitres de peroxyde d’hydrogène à 30 % pour préparer un mélange de pervanadate frais. Pour phosphorer les versions marquées de PD-1, retirez les supports des cellules transfectées PD-1-GFP.
Ajouter 10 millilitres de DMEM ordinaire et 10 microlitres de pervanadate à chaque assiette. Incuber dans l’obscurité à température ambiante pendant 15 minutes. Après cela, laver les cellules trois fois dans le PBS glacé à l’aide de cinq millilitres de PBS par lavage.
Lors de l’immunoprécipice, toutes les étapes doivent être effectuées soit sur la glace ou à quatre degrés Celsius. Complétez le tampon de lyse avec des inhibiteurs de protéase en dissolvant un comprimé des inhibiteurs en 10 millilitres de tampon. Ajoutez également un millimolaire d’orthovanadate de sodium au tampon qui sera utilisé sur les plaques transfectées PD-1-GFP.
Ajouter 500 microlitres de tampon de lyse glacée aux cellules, en s’assurant d’ajouter le tampon de lyse contenant l’orthovanadate de sodium aux plaques contenant des cellules transfectées PD-1-GFP. Utilisez un grattoir cellulaire pour retirer et recueillir immédiatement les cellules des plaques. Transférer les lysates dans des tubes froids de 1,5 millilitre et les faire pivoter à 0,005 fois la gravité et à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes.
Pour recueillir le supernatant post-noyaux des lysates, faites-les tourner à 10 000 fois la gravité et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Transférer les supernatants dans de nouveaux tubes et jeter la pastille. Conservez les supernatants pour la deuxième série de six plaques sur la glace pour une analyse ultérieure du WCL.
Pour commencer à préparer des perles anti-GFP, secouez doucement la bouteille contenant les perles avant de l’ouvrir pour éviter le décantation. Retirez 40 microlitres des perles anti-GFP du lisier par chaque condition. Centrifugeuse à 500 fois la gravité et quatre degrés Celsius pendant trois minutes.
Retirer le supernatant pour laver les perles, en s’assurant de minimiser le contact entre la pipette et les perles pour éviter la perte. Resuspendez les perles dans 80 microlitres de tampon de lyse par échantillon. Ajouter les perles lavées directement à la cellule lysate à partir des cellules d’expression PD-1-GFP de la première série de quatre plaques.
Tournez à 0,005 fois la gravité pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius pour immunoprécipifier les protéines étiquetées GFP. Lavez les perles trois fois à l’aide d’un millilitre de tampon de lyse froide qui ne contient pas d’orthovanadate pour chaque lavage. Puis centrifugeuse à 2500 fois la gravité pendant 10 secondes.
Diviser le lysate du SHP2 actif à partir du premier ensemble de plaques en trois portions égales et ajouter une partie à chacun des trois tubes contenant les perles lavées PD-1-GFP contenant. Ajouter 1/3 du volume de lysate des cellules non infectées au deuxième tube des perles PD-1-GFP de type sauvage. Jetez les 2/3 restants.
Incuber les perles pendant quatre heures à quatre degrés Celsius avec rotation douce à 0,005 fois la gravité. Après cela, lavez les perles deux fois à l’aide d’un millilitre de tampon de lyse froide pour chaque lavage. Ajouter 80 microlitres de tampon de lyse à chaque échantillon, en veillant à ce que le volume total dans chaque tube soit de 100 microlitres.
À l’aide d’une pointe de pipette coupée, pipette doucement de haut en bas pour mélanger. Transférer ensuite 50 microlitres de chaque tube en deux tubes frais de 1,5 millilitre. Lavez les perles une fois avec le tampon de lavage de phosphatase.
Retirez ensuite complètement le surnatant. Ajouter 100 microlitres de tampon d’essai aux perles et incuber à 30 degrés Celsius pendant 30 minutes sous une douce agitation. Lorsque le tampon devient jaune, mettre fin à la réaction en ajoutant 50 microlitres d’une solution molaire d’hydroxyde de sodium.
Centrifugeuse à 2500 fois la gravité pendant 10 secondes. Après cela, transférer le supernatant dans deux puits de demi-zone dans une plaque de 96 puits. Lisez les absorbants à 405 nanomètres et exprimez les résultats comme densité optique relative sur la version de type sauvage de contrôle de PD-1-GFP.
Faites d’abord tourner les perles à 2000 fois la gravité et quatre degrés Celsius pendant 30 secondes et retirez le supernatant. Ajouter 20 microlitres de deux fois tampon Laemmli et faire bouillir à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes. À l’aide d’un kit BCA, mesurer la concentration en protéines des contrôles d’entrée.
Transférer 30 microlitres de l’échantillon le plus dilué dans un nouveau tube. Utilisez le tampon de lyse pour diluer le reste des contrôles d’entrée à la même concentration que l’échantillon le plus dilué. Transférez ensuite 30 microlitres de chacune des commandes d’entrée diluées vers un nouveau tube.
Ajouter des volumes égaux de deux fois tampon Laemmli aux lysates et les faire bouillir 95 degrés Celsius pendant cinq minutes. Après cela, faites tourner les perles à 2000 fois la gravité et quatre degrés Celsius pendant 30 secondes avant d’effectuer l’analyse de tache occidentale telle que décrite dans le protocole de texte. Dans cette étude, une co-immunoprécipitation combinée et un essai d’activité enzymatique sont développés pour l’évaluation parallèle des interactions et de l’activation des enzymes réceptifs.
Sans surprise, SHP2 n’a pas réussi à se lier à PD-1 lorsque l’ITSM a été muté. Remarquablement, la version mutante de l’ITIM inhibait la liaison SHP2 seulement dans une mesure limitée. Néanmoins, l’analyse d’activité SHP2-phosphatase révèle que l’ITIM et l’ITSM sont tout aussi indispensables pour l’activité enzymatique.
Ceci indique un modèle d’activation en deux étapes dans lequel SHP2 est plié dans une conformation autoinhibited dans des conditions de repos. Lors de l’activation du PD-1, SHP2 est recruté à l’ITSM phosphorylated. Toutefois, l’ITIM doit également être phosphorylatée pour déployer SHP2 dans sa conformation active.
Après son développement, cette technique peut ouvrir la voie à des chercheurs dans le domaine de la signalisation cellulaire pour explorer la fonction des domaines protéiques dans les interactions récepteurs-enzymes.
