L’objectif global de ce protocole est de décrire la fabrication de dispositifs microfluidiques ébréchés pour récapituler in vitro la fonctionnalité au niveau des organes. Ce protocole décrit une façon de fabriquer des dispositifs ébréchés d’organe récapitulant la fonction de niveau d’organe in vitro. Le func, les dispositifs, tels que ceux-ci, sont en fait fabriqués à l’aide de moules imprimés 3D à partir d’un caoutchouc de silicium souple.
Ce caoutchouc nous permet d’imprégner réellement ces dispositifs de repères mécaniques qui nous permettent d’étirer le tissu comme vous l’entrez, disons un poumon ou un intestin. Nous ajoutons également la profusion, qui imite le flux sanguin et le flux d’autres fluides corporels dans les systèmes organiques. Maintenant pris ensemble, ces dispositifs nous permettent de recréer et d’essayer de comprendre la physiologie complexe qui se produit in vivo.
Mais faites-le in vitro. Donc, essentiellement, nous expérimentons sur les humains, mais pas sur les gens. C’est donc un moyen très efficace de combler le fossé entre les études sur les animaux, qui se font toujours dans le développement précliniques de la thérapeutique, puis avant les études humaines, qu’on appelle les essais cliniques, où il y a un risque beaucoup plus grand pour l’homme, pour la sécurité humaine.
Et donc ces dispositifs aident à combler la fracture et nous permettent effectivement de développer de nouvelles thérapeutiques et de comprendre la biologie de base qui se produit réellement dans des systèmes complexes tels que l’homme. Préparation du canal supérieur. Essuyez le côté brillant de chaque pièce en polyuréthane avec de l’éthanol et des lingettes de chambre propres.
Placez le côté brillant du polyuréthane sur le côté ouvert du moule en place moule. Placer le moule et les assemblages de polyuréthane dans le gabarit, côté texturé contre l’extrémité du gabarit. Continuez à le faire jusqu’à ce que tous les moules ont été placés dans le gabarit.
Serrez le gabarit en tournant sa poignée à l’aide d’une clé, jusqu’à ce que l’espacement du gabarit soit de 25 millimètres de largeur. Faire un bateau de papier d’aluminium entourant le moule en place gabarit. Verser le PDMS dans le puits de chaque moule jusqu’à ce qu’il soit plein.
Une fois que le gabarit entier est rempli, placez le gabarit dans le dessiccateur sous vide. Après une heure, retirer du dessiccateur. Et placer dans le four Centigrade à 60 degrés pendant au moins quatre heures.
Démonter le gabarit à l’aide d’une clé. Retirer les bandes de polyuréthane de chaque moule. Et jeter.
Démouler soigneusement les pièces PDMS de leurs moules et les poser côté dispositif vers le haut. Alignez la lame du grattoir à l’extrémité de l’encoche de l’onglet. Et couper chaque extrémité pour cinguler les composants du haut.
Conserver les pièces finies dans des boîtes carrées de Petri. Conservez les pièces dans des armoires à pression positive à température ambiante. Préparation du canal inférieur.
Verser 10,5 grammes de PDMS dans le moule. Le pistolet à air comprimé peut être utilisé très doucement pour déplacer le PDMS sur l’espace. Placer les moules dans le dessiccateur sous vide.
Après une heure, déplacer les moules à un niveau 60 degrés Centigrade four. Placez le moule sur la table dans un capot d’écoulement laminaire. Desserrer le PDMS du bord du moule.
Saisir un coin et peler doucement le PDMS de la surface du moule. Une fois complètement enlevé, inverser et poser sur la surface de travail de sorte que les caractéristiques du canal sont face vers le haut. Couper le long des bords extérieurs à l’aide d’un coupeur de tuiles.
À l’aide de forceps plats à pagaie, mentez les pièces latérales sur du ruban adhésif pour enlever les débris. Retirez une partie du ruban d’emballage. Faites glisser l’extrémité lâche de la pièce à travers la glissière.
L’extrémité lâche stratifié avec le verre. Couvrir les caractéristiques de scotch. Conservez les pièces dans des armoires à pression positive à température ambiante.
Préparation de la membrane PDMS. Vérifiez que les gaufrettes sont exemptes de PDMS à l’arrière. Placez chaque gaufrette membranaire dans les fentes désignées.
Utilisez la seringue d’un mL pour placer 09 mL de PDMS sur le centre de chaque tableau de poteau de gaufrettes membranaires. Laissez le PDMS reposer pendant au moins cinq minutes. Permettre au PDMS de se propager dans tout le poteau de la plaquette membranaire.
Ne passez pas à l’étape suivante tant qu’au moins 75 % du tableau de poste n’est pas couvert par pdms. Plasma traiter la bande de polycarbonate en utilisant les conditions décrites dans le protocole. Retirez la feuille de polycarbonate de la machine à plasma et utilisez des ciseaux pour couper les feuilles de polycarbonate en carrés de 45 millimètres par 45 millimètres.
Déposer le côté plasmatique traité des carrés de polycarbonate sur le PDMS, centré sur la gaufrette membranaire. Placez l’espaceur PDMS au centre de la place en polycarbonate. Ensuite, placez le polycarbonate texturé précoupé.
Insérer des plateaux de sorte que le plateau trois est à l’arrière, plateau deux est au milieu, et plateau un est à l’avant. Plateau un a un cran pour l’alignement. Ouvrez la soupape de pression de sortie et ouvrez très lentement la soupape de pression d’entrée.
C’est ainsi que les quatre kilogrammes de force sont progressivement appliqués sur chaque gaufrette membranaire, par opposition à instantanément ce qui peut briser les gaufrettes. Retournez le commutateur de l’AMF pour commencer le cycle de séchage. Fermez ensuite la vanne de pression d’entrée et ouvrez les soupapes de pression de sortie pour libérer la pression des cylindres d’air.
Retirez les plateaux et amenez-les au capot d’écoulement laminaire. Peler délicatement le polycarbonate texturé. Retirez soigneusement l’espaceur PDMS.
Inspecter la membrane PDMS pour les zones avec à travers les trous. Utilisez un marqueur pour tracer le contour de la zone du trou à travers. Marquez également les trous ou les défauts sur les membranes.
Il s’agit d’un exemple d’une membrane non marquée et marquée. À l’aide d’une pince à épiler de gaufrette, desserrer les gaufrettes du plateau. Retirer chaque membrane de la gaufrette et la placer sur la boîte de Pétri.
La membrane PDMS sera démodée de la gaufrette et sera collée au support en polycarbonate. Conservez les pièces dans des armoires à pression positive à température ambiante. Assemblage et préparation.
À l’aide de scotch fini mat, nettoyez les membranes PDMS ainsi que l’intérieur de la boîte de Pétri pour enlever les débris. Collez soigneusement le côté caractéristique de chaque haut de canal grand pour enlever les débris. Placer les dessus dans la boîte de Pétri avec la membrane PDMS.
Sachez que certaines membranes peuvent prendre une ou deux parties supérieures. Les principaux canaux de chaque partie supérieure doivent s’insérer dans la zone marquée à l’intérieur de la membrane. Charger les boîtes de Pétri dans le plasma.
Membrane de traitement de plasma et dessus selon le protocole écrit. Une fois le cycle de collage terminé, retirer la vaisselle et déposer les parties supérieures activées sur la membrane. Placer au four Centigrade à 60 degrés pendant au moins deux heures.
À l’aide d’un scalpel, tracer autour du périmètre du dessus collé pour le séparer du porte-polycarbonate. Une fois la pièce tracée, peler le dessus du polycarbonate. La membrane PDMS qui s’est collée au haut doit également peler du transporteur.
À l’aide d’une pince à épiler, retirer la membrane des ports qui accèdent au canal inférieur. Ne laissez aucune partie de la membrane couvrant le port d’accès. En outre, enlever les débris ou la poussière avec des pincettes.
Assemblage de puces. Côté caractéristique vers le haut, plasma traiter les assemblages haut avec des fonds. Sous un microscope inversé, aligner l’assemblage supérieur avec la moitié inférieure.
Placer au four Centigrade à 60 degrés pendant au moins deux heures. Résultats. Le protocole présenté ici décrit la fabrication évolutive de puces d’organes PDMS. Ces dispositifs permettent la culture de deux types distincts de tissus abondants sur une membrane poreuse élastique.
Les canaux PDMS sont coulés à l’aide de moules imprimés 3D, ce qui accélère le prototypage de nouvelles conceptions. Les canaux supérieur sont coulés dans des moules sous compression contre un joint en polyuréthane conforme pour produire des composants avec des ports moulés. Tandis que les composants du canal inférieur sont coulés dans des plateaux et manipulés sur le support de glissière de microscope.
Cette approche de fabrication combine le modelage à plusieurs échelles des pièces en une seule étape, ce qui permet de gagner du temps, d’améliorer la reproductibilité et la traçabilité, et de réduire les débris générés par le poinçonnage du port et plusieurs étapes de coupe. Les membranes poreuses sont essentielles à la fonction de la puce d’organe, et l’approche de fabrication basée sur la coulée contre les plaquettes de silicium à motifs entraîne des membranes d’épaisseur constante et de finition de surface. La manipulation par l’intermédiaire des supports de polycarbonate permet la production et le stockage plus grands de lot.
La puce d’organe assemblée se compose de deux canaux de profusion dans un paquet optiquement transparent. Dans la région qui se chevauche, une membrane poreuse pdms permet l’interaction tissulaire-tissulaire des métabolites, protéines, thérapeutiques, pathogènes et cellules pour récapituler la fonction des puces d’organes tandis que deux canaux parallèles de chaque côté sont utilisés pour fournir une tension mécanique, en utilisant l’actionnement cyclique sous vide. La porosité de la membrane PDMS soutient biomédicalement le flux des métabolites, des facteurs de croissance, et même des cellules entre la vasculature et le parenchyme d’organe.
La perméabilité apparente de la membrane a été déterminée à l’aide de la di-concentration dans les canaux de sortie avec et sans cellules intestinales Caco-2. Les couches de cellules de puce intestinale fournissent une barrière sensiblement accrue à la perméabilité. La puce d’organe peut être actionnée en utilisant les canaux parallèles de vide pour appliquer quantitativement et reproductiblement la charge cyclique de contrainte à la membrane, et donc aux tissus cultivés.
Cette souche cyclique combinée à la profusion des médias soutient la différenciation cellulaire pour mieux imiter la physiologie in vivo des organes, comme la formation de villosités dans la puce intestinale. En utilisant le protocole décrit ici, vous devriez maintenant être en mesure de fabriquer une puce d’organe PDMS extensible.
