Name: electrophysiological recording from drosophila trichoid sensilla in response to odorants of low volatility
Uploaded: 2017-07-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility at JoVE.com

Nous remercions Ye Zhang pour l&#39;aide avec les traces d&#39;échantillons et Tin Ki Tsang pour l&#39;aide avec les images. Ce travail a été soutenu par un prix de carrière précoce de la Fondation Ray Thomas Edwards et une subvention NIH (R01DC015519) aux subventions de C.-YS et NIH (R01DC009597 et R01DK092640) à JWW

1. Préparation du matériel pour l&#39;enregistrement at4 <ol><li> Utilisez un appareil extracteur à pipette pour préparer des électrodes avec des capillaires en verre aluminosilicaté (OD 1,0 mm, ID 0,64 mm). Enlevez légèrement la pointe de l&#39;électrode de référence avec une paire de pinces fines pour faciliter l&#39;insertion dans le clypeus de la mouche ( c&#39;est -à- dire une plaque arrondie à l&#39;avant de la tête de mouche, au-dessus des embouchures). NOTE: Les hommes WT de 7 jours (Berlin) ont été utilisés dans cette étude. Utiliser la solution saline AHL 14 comme électrolyte pour les deux électrodes. </li><li> Préparer 1 litre de AHL en mélangeant 900 mL d&#39;eau distillée avec 6,312 g de NaCl, 0,373 g de KCl, 0,337 g de NaHCO 3, 0,1120 g de NaH 2 PO 4, 1,892 g de trehalose ּ 2 H 2 O, 3,423 g de saccharose, 1,192 g de HEPES et 8,2 ml de MgCl 2 1 M. En utilisant de l&#39;eau distillée, amener le volume total jusqu&#39;à 1 L. Apportez le pH à 7,4 en utilisant du NaOH 1 N et stérilisez la solution avec unSystème de filtre à vide. Pour un stockage à long terme, conservez les aliquotes AHL à 4 ° C. NOTE: Les livraisons cohérentes d&#39;acide palmitoleique dépendent de l&#39;uniformité entre les cartouches. Il est essentiel que chaque cartouche soit assemblée de manière reproductible. </li><li> À l&#39;aide d&#39;une lame de rasoir, retirez 0,9 cm de la pointe d&#39;une pointe de pipette de 200 μL pour créer la première section de cartouche, mesurant 4,1 cm; Se référer aux dimensions détaillées dans la figure 1A . Utilisez une autre pointe de pipette de 200 μL et retirez 1,7 cm et 1,5 cm de la pointe et de la base, respectivement, pour créer la deuxième section de la cartouche, mesurant 1,8 cm ( figure 1A ). Utilisez une règle pour assurer la reproductibilité. </li><li> Utilisez un perforateur ⅛ &quot;pour couper les disques du papier filtre. </li><li> Utilisez une pince pour placer un disque de papier filtre à l&#39;extrémité de la seconde section de la cartouche. Confirmez visuellement qu&#39;il y a une ouverture dans la pointe de la cartouche à travers laquelle l&#39;air peut passer. </li><li> Fixez les première et seconde sections de cartouche ensemble, comme le montre la figure 1A . Angle de la deuxième section de la cartouche vers le bas pour faciliter le pointage carré en vue de la préparation ( Figure 1B ). </li><li> Connectez la cartouche avec le tube d&#39;injection d&#39;odeur, qui est monté sur un micromanipulateur. REMARQUE: cette conception permet de faire pivoter la cartouche vers l&#39;extérieur pour faciliter l&#39;échange ( figure 1C ). </li><li> Réglez le flux d&#39;air humidifié constant à 2 L / min dans un contrôleur de masse et le flux d&#39;odorant à 500 mL / min dans un autre contrôleur de masse. </li><li> En utilisant le logiciel (voir la table des matières ), programmez la procédure pour administrer une bouffée d&#39;odeur de 500 ms. </li></ol> 2. Préparation des solutions d&#39;odeur d&#39;acide palmitoleique pour la livraison NOTE: Or47b ORN répondent à l&#39;acide cis -et trans- palmititoleique. Comme l&#39;acide palmitoleique est instable à RT, les stocks sont stockés à -20 ° C et utilisés dans un mois à l&#39;ouverture. L&#39;éthanol est le solvant choisi pour l&#39;acide palmitoléique. <ol><li> Utilisez un mélangeur à vortex pour mélanger soigneusement 10 μL de stocks d&#39;acide cis- ou trans- palmitoléique ou des dilutions avec 90 μL d&#39;éthanol à 100% pour des dilutions en série à dix fois dans des microtubes de 1,7 ml. Préparer des dilutions d&#39;acide palmitoleique fraîches quotidiennement avant les expériences et utiliser dans une journée. REMARQUE: pour les odeurs qui ne sont pas solubles dans l&#39;éthanol, un flacon en verre est recommandé pour la préparation des dilutions d&#39;odeurs avec d&#39;autres types de solvants organiques. </li><li> En utilisant une micropipette P10, appliquer 5 μL de solutions d&#39;acide cis- palmititoïques des dilutions souhaitées sur le papier filtre dans chaque cartouche correspondante. NOTE: Le dosage le plus élevé (10 -1 ) contient 450 μg du composé. Pour les solutions d&#39;acide trans- palmititoleique, appliquez 4,5 μL à la place pour que la dose la plus élevée (10 -1 ) contienne également 450 μg de tIl a composé. </li><li> Pour évaporer complètement le solvant, placer les cartouches d&#39;acide palmitoleique dans un dessiccateur sous vide pendant 1 h à la température ambiante et 7,59 mmHg de pression. REMARQUE: les cartouches peuvent être utilisées jusqu&#39;à 4 h à la RT. </li></ol> 3. Préparation de la drosophile pour l&#39;accès facile à l&#39;at4 Sensilla pour les enregistrements électrophysiologiques In Vivo NOTE: Les mouches WT (Berlin) sont élevées dans un milieu de farine de maïs standard à 25 ° C dans un cycle de lumière-obscurité 12:12. Lors de l&#39;éclosion, les mouches sont séparées par sexe en groupes de dix, selon lesquelles ils sont hébergés en groupe jusqu&#39;à 7 jours d&#39;âge. Or47b Les ORN dans les mouches mâles et femelles répondent à l&#39;acide palmitoléique. Pour simplifier, seules les mouches mâles sont examinées dans la présente étude. <ol><li> Assembler une glissière de préparation de mouche: sur une glissière en verre, placez une lamelle de verre (18 x 18 mm 2 ) sur une petite quantité d&#39;argile de modélisation, formant un angle de ~ 3 ° avec la glissière en verre. Placez un ruban adhésif double face sur l&#39;intérieurDge de la lamelle et sur la zone de la glissière immédiatement en dessous. Remplacez-le par un ruban frais pour chaque jour d&#39;enregistrement ( Figure 2A ). </li><li> Utilisez un aspirateur à mouches 15 pour collecter la mouche d&#39;intérêt dans le tube, puis ajoutez une pointe de pipette de 200 μL sur l&#39;extrémité du tube. Appuyez simultanément sur le tube vers l&#39;avant tout en soufflant de l&#39;air dans le tube pour pousser la mouche jusqu&#39;à la fin de la pointe de la pipette. Utilisez une lame de rasoir pour couper juste en dessous du corps de la mouche et 2 longueurs de tête au-dessus de la mouche. </li><li> Tamp le bas de la pointe de la pipette avec l&#39;argile de modélisation, poussant la mouche vers le haut jusqu&#39;à ce que les antennes et les clypeus soient exposés ( Figure 2B ). Pour éviter de tuer la mouche, ajoutez seulement suffisamment d&#39;argile pour exposer les antennes et l&#39;aristae, car cela empêche l&#39;abdomen de la mouche d&#39;être écrasé. En outre, ajouter de l&#39;argile lentement et doucement pour éviter toute contraction soudaine. Confirmez que la mouche est en vie en vérifiant l&#39;antenneOu le mouvement de proboscis. </li><li> Utilisez une pince pour manœuvrer la pointe de la pipette qui abrite la mouche. Orientez la tête de façon à ce que le clype se trouve à droite de l&#39;observateur. Réglez la préparation le long de la lamelle à l&#39;aide de pinces fines jusqu&#39;à ce que le côté latéral de l&#39;antenne soit placé contre la surface de lamelles scellées ( Figure 2B ). </li><li> Placez une tige de maintien sur l&#39;arista pour fixer l&#39;antenne sur le ruban double face pour éviter tout mouvement ( Figure 2B ). REMARQUE: La tige de retenue est tirée d&#39;un capillaire en verre borosilicaté avec un extracteur de pipette et maintenue en position avec l&#39;argile de modélisation ( Figure 2A ). </li><li> Placez la préparation sur la scène de la plate-forme ( Figure 2C ). À l&#39;aide du microscope, confirmez que les trichoïdes sont visibles le long du bord latéral distal du troisième segment de l&#39;antenne. REMARQUE: Idéalement, la sensilla devrait être nettement décalée en arrière-plan, ce qui simplifie leur<html> Identification et facilite l&#39;enregistrement ( Figure 3 ). Dans cette préparation, la majorité des sensillas trichoïques accessibles sont du type at4. </li><li> Maintenir la préparation sous un flux d&#39;air humidifié constant (2 L / min) délivré via un tube d&#39;alimentation d&#39;air séparé d&#39;une distance d&#39;environ 2 cm de la préparation ( Figure 4 ), comme décrit précédemment 2 , 15 . </li></ol> 4. Enregistrement de l&#39;activité at4 Sensillum à partir d&#39;or47b ORN dans les Trichoids at4 en réponse à l&#39;acide palmitoleique <ol><li> Insérez l&#39;électrode de référence dans le clypeus ( Figure 3A ). Pour éviter les dommages aux tissus, assurez-vous que l&#39;électrode est insérée juste en dessous de la surface, où elle peut entrer en contact avec l&#39;hémolymphe sous la cuticule, avec un mouvement rapide et lisse. </li><li> Abaissez l&#39;électrode d&#39;enregistrement lentement jusqu&#39;à ce qu&#39;elle entre dans le même plan de vue que le sensillum cible (= &quot;Xfig&quot;&gt; Figure 3B). Enregistrez sous un objectif objectif 50X. NOTE: La cuticule tricoïdale dure nécessite l&#39;insertion de l&#39;électrode d&#39;enregistrement dans la base sensible, dont la surface plus large fournit une cible plus grande qui réduit la probabilité que l&#39;électrode soit déviée ( Figure 3B , insertion). </li><li> Avant d&#39;appliquer des stimuli d&#39;odeur à un sensillum, respecter les critères de sélection suivants; Tout échec de la trichoid ne répond pas à ces normes devrait être rejeté et un autre sensillum choisi à la place. <ol><li> Observez un rapport signal / bruit élevé (voir la Figure 3C pour un exemple). </li><li> Observez les pointes identifiables des neurones at4A et at4C ( Figure 3C ). REMARQUE: Il est à noter que l&#39;amplitude de l&#39;amplitude at4B apparaît très semblable à at4A 10 et ne peut être identifiée facilement sans stimulation des odeurs. </li><li> Observez que le taux de tir basal des neurones at4A estEnviron ou moins de 20 Hz. NOTE: Ce critère est spécifique pour at4A car le taux de tir basal pour le neurone est supérieur à celui des ORN basiques 2 . Un tir basal beaucoup plus élevé indique que les neurones peuvent avoir été endommagés lors de l&#39;insertion d&#39;électrodes. </li></ol></li><li> Connectez la cartouche au tube de distribution d&#39;odorant. Commencez par le contrôle du solvant et ensuite les odorants, des concentrations faibles à élevées. Utilisez le micromanipulateur pour manoeuvrer la cartouche vers la préparation tout en orientant la cartouche directement à la tête de la préparation. Confirmez visuellement que la cartouche est directement dirigée vers l&#39;antenne ( Figure 4 ) à quelques millimètres. REMARQUE: L&#39;objectif est d&#39;orienter l&#39;ouverture de la cartouche directement sur l&#39;antenne et de la positionner à proximité du tissu cible. </li><li> Assurez-vous que la cartouche odorante est séparée de l&#39;électrode d&#39;enregistrement sur sa droite de 1 à 2 mm et de la pré-P glisse en dessous d&#39;environ 1 mm. REMARQUE: Dans la configuration décrite ici, la cartouche odorante est étroitement liée à l&#39;électrode d&#39;enregistrement, à l&#39;électrode de référence et à la diaphane ( Figure 4 ). REMARQUE: Faites attention à la distance entre la cartouche et les électrodes d&#39;enregistrement / référence. Une distance d&#39;environ 4 mm est recommandée 1 . Un contact involontaire peut mettre fin au signal et briser l&#39;extrémité de l&#39;électrode d&#39;enregistrement, endommager le neurone actuel et compliquer d&#39;autres enregistrements. REMARQUE: Considérez la distance séparant la cartouche et la diapositive à la mouche. Toucher le lamelle peut également déloger l&#39;électrode d&#39;enregistrement pour perturber l&#39;enregistrement. </li><li> Appuyez sur &quot;Enregistrer&quot; dans le logiciel d&#39;acquisition de données pour commencer l&#39;enregistrement. REMARQUE: pour chaque enregistrement de 10 s, une seule impulsion d&#39;odeur de 500 ms est livrée directement à l&#39;antenne, comme décrit à l&#39;étape 1.9. </li><li> Après une application odorante,Retirez soigneusement la cartouche avant de la remplacer par une cartouche de la concentration la plus élevée suivante. Continuez jusqu&#39;à ce que la gamme de dosage soit obtenue. REMARQUE: Il est recommandé qu&#39;un seul or47b ORN soit enregistré de chaque vol pour éviter tout effet possible de l&#39;adaptation. </li><li> Rincer soigneusement l&#39;électrode d&#39;enregistrement avec de l&#39;eau distillée après avoir fini l&#39;enregistrement pour la journée. </li><li> Analyser et tracer les données à l&#39;aide d&#39;un logiciel d&#39;analyse hors ligne disponible dans le commerce. </li></ol>

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Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Ici, nous avons décrit une procédure par laquelle les réponses des ORS Or47b à l&#39;acide palmitoleique peuvent être induites et enregistrées de manière robuste. Nous avons modifié une méthode conventionnelle de traitement des odeurs longue distance 2 , 7 , 10 pour dépanner le problème de l&#39;apport insuffisant d&#39;odorant à la phéromone. Nous avons abordé la question de la volatilité à faible teneur en ode...

<html> Les ORN de Drosophila répondent à un grand nombre d&#39;odorants, avec des longueurs de chaîne de carbone très variées et une variété de groupes fonctionnels, y compris les esters, les alcools, les cétones, les lactones, les aldéhydes, les terpènes, les acides organiques, les amines, les composés soufrés, les hétérocycliques et les aromatiques 2 , 3 . Les odeurs variées dans leurs caractéristiques physicochimiques peuvent avoir des volatilités nettement différentes, indiquées par la pression de vapeur du composé. Notamment, les odeurs biologiquement pertinentes pour Drosophila melanogaster diffèrent énormément de leur volatilité. Par exemple, les ORN Ir92a répondent à l&#39;ammoniac 4 , très volatil, avec une pression de vapeur de 6,432 mmHg à 20 ° C. En revanche, les ORN Or67d répondent à une phéromone masculine, l&#39;acétate de cis -acétate de vaccin ( c VA) 5 , 6 , dont la pression de vapeur est de 43 mmHg à 20 ° C. Ove_content &quot;&gt; L&#39;étude de la réponse olfactive aux odorants de faible volatilité est particulièrement difficile avec les méthodes classiques d&#39;administration d&#39;odeurs, dans lesquelles des odorants sont délivrés par un flux d&#39;air porteur sur une distance relativement longue ( c.-à-d. Plusieurs centimètres). En tant que tel, les réponses olfactives rapportées À un odorant donné à faible volatilité peut varier considérablement selon la conception du système de distribution d&#39;odeurs. Par exemple, la réponse signalée des ORN Or67d à une dose élevée de c VA varie de ~ 40 7 -&gt; 200 pointes / s 6 . de plus, la fourniture inefficace des c VA avec les méthodes classiques d&#39;administration est probablement attribuable à des résultats faussement négatifs, ce qui conduit à l&#39;interprétation que c VA par elle - même pas suffisante pour activer Or67d Orns 8. Cette interprétation a été contestée plus tard par une autre étude utilisant un Méthode de livraison de l&#39;odeur proche de la gamme 9. Il est donc imperaAfin de développer un système robuste d&#39;administration d&#39;odeurs pour la présentation efficace d&#39;odorants de faible volatilité. Récemment, nous avons identifié plusieurs acides gras cuticulaires à longue chaîne comme ligands pour Or47b ORN. Ils sont logés dans le Sensillum Trichoid Antenal de type 4 (at4). Parmi les odorants d&#39;acides gras à longue chaîne, nous avons constaté que l&#39;acide palmitoleique fonctionne comme une phéromone aphrodisiaque qui favorise la parade masculine en activant Or47b ORN 1 . Cependant, dans une autre étude utilisant une méthode classique d&#39;administration d&#39;odeur, le laurate de méthyle a montré des réponses des ORN Or47b, alors que l&#39;acide palmitoleique n&#39;a suscité aucune réponse lorsqu&#39;on a été présenté à la même distance 10 . Par rapport à c VA, les acides gras à longue chaîne sont encore moins volatils, avec des pressions de vapeur inférieures à 0,001 mmHg à 25 ° C 11 . La faible volatilité inhérente aux odeurs d&#39;acides gras à longue chaîne, qui empêche une présentation efficace à l&#39;antenne viaLes systèmes conventionnels d&#39;odeur-livraison, ont probablement représenté les résultats faussement négatifs 10 . Cette incohérence souligne l&#39;insuffisance des systèmes classiques d&#39;administration d&#39;odeurs dans la présentation d&#39;odorants à faible volatilité. On a précédemment montré que la livraison efficace des odeurs cuticulaires à la mouche nécessite une étroite proximité entre la source d&#39;odeurs et le tissu cible 6 . Ainsi, pour caractériser pleinement les effets des phéromones biologiquement actives tout en imitant la distance dont elles sont probablement rencontrées par les mouches des fruits dans la nature 12 , 13 , nous avons convenu que la distance minimale doit être hautement prioritaire dans notre procédure. Notre méthode présente d&#39;autres avantages, y compris la compatibilité avec les plates-formes et les techniques d&#39;électrophysiologie standard. Les configurations de plates-formes préexistantes nécessitent une modification minimale pour tenir compte de ce protocole, et la plupart des étapes de SSR ne nécessitent que des ajustements mineurs. CeRend notre technique facilement accessible aux chercheurs expérimentés en SSR. En outre, notre technique permet la présentation d&#39;odorants à faible volatilité avec un déclenchement et un décalage brusques, en corrélant la délivrance de stimulus avec la réponse neuronale. Enfin, la disposition du matériel facilite les échanges rapides entre les cartouches odorantes, accélère la collecte des données sur une gamme de dosage souhaitée. Nous commençons par examiner la préparation des électrodes de référence et d&#39;enregistrement, la solution de l&#39;hémolymphe pour adultes (AHL), les cartouches d&#39;administration d&#39;odorant et l&#39;olfactomètre correspondant. Nous discutons ensuite de la préparation des solutions d&#39;odorant d&#39;acide palmitoleique, suivies de la préparation de la mouche pour l&#39;enregistrement. Nous examinons les critères de sélection d&#39;un sensillum trichoïde pour enregistrer et examinons de plus près le positionnement de la cartouche odorante avant de présenter les données représentatives obtenues selon cette méthode. Enfin, nous concluons en explorant des applications utiles de cette techniqueCertains problèmes rencontrés et leurs solutions.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Prep Setup &amp;amp; Miscellaneous Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette Puller Instrument&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instruments&lt;br/&gt; Novato CA USA</td><td>P97</td><td>Pipette Puller</td></tr><tr><td>Borosilicate Glass Capillaries</td><td>World Precision Instruments&lt;br/&gt; Sarasota FL USA</td><td>1B100F-4</td><td>to make holding rods</td></tr><tr><td>Aluminosilicate Glass Capillaries&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instruments&lt;br/&gt; Novato CA USA</td><td>AF100-64-10</td><td>to make electrodes</td></tr><tr><td>Superfrost Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific&lt;br/&gt; Pittsburgh PA USA</td><td>12-550-143</td><td>for fly-prep station</td></tr><tr><td>Permanent Double Sided Tape</td><td>Scotch&lt;br/&gt; St. Paul MN USA</td><td>NA</td><td>for fly-prep station</td></tr><tr><td>Upright microscope</td><td>Olympus&lt;br/&gt; Shinjuku Tokyo Japan</td><td>BX51</td><td>for recording rig</td></tr><tr><td>Plastalina modeling clay</td><td>Van Aken&lt;br/&gt; North Charleston SC USA</td><td>B0019QZMQQ</td><td>for prep station and to stablize the holding rod</td></tr><tr><td>Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Unit with SFCA Membrane, 0.45 mm</td><td>Nalgene&lt;br/&gt; Rochester NY USA</td><td>#156-4045</td><td>to sterilize AHL solution</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Cartridge Materials&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;micro;L pipette tip&amp;nbsp;</td><td>VWR&lt;br/&gt; Radnor PA USA</td><td>53508-810</td><td>to make odor cartridges and fly prep</td></tr><tr><td>Filter Paper</td><td>Whatman&lt;br/&gt; Maidstone Kent UK</td><td>740-E</td><td>to make odor cartridges&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Vacuum Desiccator&amp;nbsp;</td><td>Cole-Parmer&lt;br/&gt; Vernon Hills IL USA</td><td>VX-06514-30</td><td>to vaporize ethanol solvent</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Odorant Materials&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cis-palmitoleic acid</td><td>Cayman Chemical&lt;br/&gt; Ann Arbor MI USA</td><td>#10009871 (CAS # 373-49-9)</td><td>Or47b odorant</td></tr><tr><td>trans-palmitoleic acid</td><td>Cayman Chemical&lt;br/&gt; Ann Arbor MI USA</td><td>#9001798 (CAS # 10030-73-6)</td><td>Or47b odorant</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Spectrum Chemical MFG.&amp;nbsp;&lt;br/&gt; New Brunswick NJ USA</td><td>E1028-500MLGL</td><td>to dilute palmitoleic acid&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Rig Setup Materials&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odorant Cartridge Micromanipulator</td><td>Siskiyou&lt;br/&gt; Grants Pass OR USA</td><td>MX130R</td><td>to position the olfactometer</td></tr><tr><td>Flow Vision software&amp;nbsp;</td><td>Alicat&lt;br/&gt; Tuscon AZ USA</td><td>FLOWVISIONSC</td><td>software to control flow rate</td></tr><tr><td>Mass Controller</td><td>Alicat&lt;br/&gt; Tuscon AZ USA</td><td>MC-2SLPM-D</td><td>to control the flow rate for humidified air</td></tr><tr><td>Mass Controller</td><td>Alicat&lt;br/&gt; Tuscon AZ USA</td><td>MC-500SCCM-D</td><td>to control the flow rate for odor stimulation</td></tr><tr><td>Clampex</td><td>Molecular Devices&lt;br/&gt; Sunnyvale CA USA</td><td>Ver. 10.4</td><td>Data acquisition software</td></tr><tr><td>Air delivery tube</td><td>Ace Glass&lt;br/&gt; Vineland NJ USA</td><td>8802-936&amp;nbsp;</td><td>to deliver humidified air</td></tr><tr><td>50X objective lens&amp;nbsp;</td><td>Olympus&lt;br/&gt; Shinjuku Tokyo Japan</td><td>LMPLFL50X</td><td>recording rig</td></tr><tr><td>Clampfit 10</td><td>Molecular Devices&lt;br/&gt; Sunnyvale CA USA</td><td>Ver. 10.4</td><td>software for spike analysis&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Igor Pro 6</td><td>WaveMetrics&lt;br/&gt; Lake Oswego OR USA</td><td>Ver. 6.37</td><td>software for data analysis&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Audio Monitor</td><td>ALA Scientific Instruments&lt;br/&gt; Farmingdale NY USA</td><td>NPIEXB-AUDIS-08B</td><td>Aurally reports individual spikes</td></tr><tr><td>Extracellular Amplifier</td><td>ALA Scientific Instruments&lt;br/&gt; Farmingdale NY USA</td><td>NPIEXT-02F</td><td>to increase the amplitude of electrical signals</td></tr><tr><td>Valve Controller</td><td>Warner Instruments&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>VC-8</td><td>to control the opening of the valve for odor stimulation</td></tr><tr><td>Recording Electrode Micromanipulator</td><td>Sutter Instruments&lt;br/&gt; Novato CA USA</td><td>MP-285</td><td>to position recording electrode</td></tr><tr><td>Headstage Amplifier</td><td>ALA Scientific Instruments&lt;br/&gt; Farmingdale NY USA</td><td>EQ-16.0008</td><td>to increase the amplitude of electrical signals</td></tr><tr><td>Oscilloscope</td><td>Tektronix&lt;br/&gt; Beaverton OR USA</td><td>TDS2000C</td><td>Visual report of individual spikes</td></tr></tbody></table>

electrophysiological recording from drosophila trichoid sensilla in response to odorants of low volatility

Les insectes dépendent de leur odorat pour guider un large éventail de comportements essentiels à leur survie, tels que la recherche d&#39;aliments, l&#39;évitement des prédateurs, l&#39;oviposition et l&#39;accouplement. Une myriade de produits chimiques de volatilité variable ont été identifiés comme des odeurs naturelles qui activent les neurones des récepteurs olfactifs d&#39;insectes (ORN). Cependant, l&#39;étude des réponses olfactives aux odorants à faible volatilité a été entravée par une incapacité à présenter efficacement ces stimuli en utilisant des méthodes classiques d&#39;administration d&#39;odeurs. Ici, nous décrivons une procédure qui permet de présenter efficacement des odorants à faible volatilité pour l&#39;enregistrement in vivo solo-sensillum (SSR). En minimisant la distance entre la source d&#39;odeurs et le tissu cible, cette méthode permet l&#39;application d&#39;odorants biologiquement salants mais inaccessibles jusqu&#39;à présent, y compris l&#39;acide palmitoléique, une phéromone stimulante ayant un effet démontré sur les ORN impliqués dans la parade et le comportement d&#39;accouplement 1 .Notre procédure offre ainsi une nouvelle voie pour tester une foule d&#39;odorants à faible volatilité pour l&#39;étude de l&#39;olfaction des insectes et de la communication de la phéromone.

Notre technique a été appliquée avec succès pour déterminer l&#39;efficacité relative des isomères trans ( Figure 5A ) versus cis ( Figure 5B ) de l&#39;acide palmitoleique. Nos données représentatives démontrent que l&#39;acide trans- palmititoleique est un ligand plus efficace pour les ORN Or47b par rapport à l&#39;isoforme cis ( figure 5C ). Un seul ...

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Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility

L&#39;objectif global de ce protocole est de démontrer comment présenter des odorants de faible volatilité pour l&#39;enregistrement à sens unique des neurones récepteurs olfactifs de Drosophila qui répondent aux phéromones cuticulaires à longue chaîne.

Enregistrement électrophysiologique de<em&gt; Drosophila</em&gt; Sensilla Trichoid en Réponse aux Odorants de Faible Volatilité

Insects rely on their sense of smell to guide a wide range of behaviors that are critical for their survival, such as food-seeking, predator avoidance, ...

electrophysiological-recording-from-drosophila-trichoid-sensilla

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility

8.8K vues.  University of California San Diego.  L'objectif global de ce protocole est de démontrer comment présenter des odorants de faible volatilité pour l'enregistrement à sens unique des neurones récepteurs olfactifs de Drosophila qui répondent aux phéromones cuticulaires à longue chaîne. 

Vidéo: Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

Enregistrements Sensillum simple chez les insectes Drosophila melanogaster Et Anopheles gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Recherche

Neurosciences

High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral paradigm, the experimenter usually assumes that the rapid diffusion of odorant molecules from the source leads to the creation of a stable gradient in the dish. To establish a quantitative correlation between sensory inputs and behavioral responses, it is necessary to achieve a more thorough characterization of the odorant stimulus conditions. In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

Haute résolution de mesure du comportement Odor-Driven dans les larves de drosophile

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral ...

Biologie

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory bulb1-5. Olfactory information in the external world is transmitted to the antennal lobe by olfactory sensory neurons (OSNs), which segregate to distinct regions of neuropil called glomeruli according to the specific olfactory receptor they express. Here, OSN axons synapse with both local interneurons (LNs), whose processes can innervate many different glomeruli, and projection neurons (PNs), which convey olfactory information to higher olfactory brain regions.
Optical imaging of the activity of OSNs, LNs and PNs in the antennal lobe - traditionally using synthetic calcium indicators (e.g. calcium green, FURA-2) or voltage-sensitive dyes (e.g. RH414) - has long been an important technique to understand how olfactory stimuli are represented as spatial and temporal patterns of glomerular activity in many species of insects6-10. Development of genetically-encoded neural activity reporters, such as the fluorescent calcium indicators G-CaMP11,12 and Cameleon13, the bioluminescent calcium indicator GFP-aequorin14,15, or a reporter of synaptic transmission, synapto-pHluorin16 has made the olfactory system of the fruitfly, Drosophila melanogaster, particularly accessible to neurophysiological imaging, complementing its comprehensively-described molecular, electrophysiological and neuroanatomical properties2,4,17. These reporters can be selectively expressed via binary transcriptional control systems (e.g. GAL4/UAS18, LexA/LexAop19,20, Q system21) in defined populations of neurons within the olfactory circuitry to dissect with high spatial and temporal resolution how odor-evoked neural activity is represented, modulated and transformed22-24.
Here we describe the preparation and analysis methods to measure odor-evoked responses in the Drosophila antennal lobe using G-CaMP25-27. The animal preparation is minimally invasive and can be adapted to imaging using wide-field fluorescence, confocal and two-photon microscopes.

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

We describe an established technique to measure and analyze odor-evoked calcium responses in the antennal lobe of living Drosophila melanogaster.

Imagerie de calcium des odeurs évoquées réponses dans le Drosophila Lobe antennaire

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

The peripheral taste response of insects can be powerfully investigated with electrophysiological techniques. The method described here allows the researcher to measure gustatory responses directly and quantitatively, reflecting the sensory input that the insect nervous system receives from taste stimuli in its environment. This protocol outlines all key steps in performing this technique. The critical steps in assembling an electrophysiology rig, such as selection of necessary equipment and a suitable environment for recording, are delineated. We also describe how to prepare for recording by making appropriate reference and recording electrodes, and tastant solutions. We describe in detail the method used for preparing the insect by insertion of a glass reference electrode into the fly in order to immobilize the proboscis. We show traces of the electrical impulses fired by taste neurons in response to a sugar and a bitter compound. Aspects of the protocol are technically challenging and we include an extensive description of some common technical challenges that may be encountered, such as lack of signal or excessive noise in the system, and potential solutions. The technique has limitations, such as the inability to deliver temporally complex stimuli, observe background firing immediately prior to stimulus delivery, or use water-insoluble taste compounds conveniently. Despite these limitations, this technique (including minor variations referenced in the protocol) is a standard, broadly accepted procedure for recording Drosophila neuronal responses to taste compounds.

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

This protocol describes extracellular recording of the action potential responses fired by labellar taste neurons in Drosophila.

Enregistrement électrophysiologique De<em&gt; Drosophila</em&gt; Labellar Goût Sensilles

The peripheral taste response of insects can be powerfully investigated with electrophysiological techniques. The method described here allows the ...

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila express gustatory receptors1,2, ion channels3-6, and ionotropic receptors7 that are involved in the detection of volatile and non-volatile sensory cues. These neurons directly contact tastants such as food, noxious substances and pheromones and therefore influence many complex behaviors such as feeding, egg-laying and mating. Electrode recordings and calcium imaging have been widely used in insects to quantify the neuronal responses evoked by these tastants. However, electrophysiology requires specialized equipment and obtaining measurements from a single taste sensillum can be technically challenging depending on the cell-type, size, and position. In addition, single neuron resolution in Drosophila can be difficult to achieve since taste sensilla house more than one type of chemosensory neuron. The live calcium imaging method described here allows responses of single gustatory neurons in live flies to be measured. This method is especially suitable for imaging neuronal responses to lipid pheromones and other ligand types that have low solubility in water-based solvents.

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

The forelegs and proboscis of Drosophila contain a rich repertoire of gustatory sensory neurons. Here, we present a method using calcium imaging to measure physiological responses from sensory neurons in the foreleg and proboscis of live flies upon exogenous application of a gustatory pheromone.

Mesurer les réponses physiologiques de<em&gt; Drosophila</em&gt; Neurones sensoriels à Lipid Phéromones Utilisation en direct d&#39;imagerie de calcium

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

Immunologie et infection

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To complicate matters even further, the odors detected by the insect nervous system usually are not single compounds but mixtures whose composition and concentration ratios vary. This leads to an almost infinite amount of different olfactory stimuli which have to be evaluated by the nervous system.
To understand which aspects of an odor stimulus determine its evaluation by the fly, it is therefore desirable to efficiently examine odor-guided behavior towards many odorants and odor mixtures. To directly correlate behavior to neuronal activity, behavior should be quantified in a comparable time frame and under identical stimulus conditions as in neurophysiological experiments. However, many currently used olfactory bioassays in Drosophila neuroethology are rather specialized either towards efficiency or towards resolution.
Flywalk, an automated odor delivery and tracking system, bridges the gap between efficiency and resolution. It allows the determination of exactly when an odor packet stimulated a freely walking fly, and to determine the animal&#180;s dynamic behavioral reaction.

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

The automated tracking system Flywalk is used for high-resolution quantification of odor-guided behavior in Drosophila melanogaster.

Haute résolution La quantification du comportement Odor-guidée dans<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Utilisation de la<em&gt; Flywalk</em&gt; Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

Méthode électrophysiologique de réponses d&#39;enregistrement intracellulaire tension de<em&gt; Drosophila</em&gt; Photorécepteurs et Interneurones à Light Stimuli<em&gt; In Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an excellent model system for such investigations due to its complex behaviors, powerful genetic techniques, and compact nervous system. Laboratory behavioral assays have long been used with Drosophila to simulate properties of the natural environment and study the neural mechanisms underlying the corresponding behaviors (e.g. phototaxis, chemotaxis, sensory learning and memory)1-3. With the recent availability of large collections of transgenic Drosophila lines that label specific neural subsets, behavioral assays have taken on a prominent role to link neurons with behaviors4-11. Versatile and reproducible paradigms, together with the underlying computational routines for data analysis, are indispensable for rapid tests of candidate fly lines with various genotypes. Particularly useful are setups that are flexible in the number of animals tested, duration of experiments and nature of presented stimuli. The assay of choice should also generate reproducible data that is easy to acquire and analyze. Here, we present a detailed description of a system and protocol for assaying behavioral responses of Drosophila flies in a large four-field arena. The setup is used here to assay responses of flies to a single olfactory stimulus; however, the same setup may be modified to test multiple olfactory, visual or optogenetic stimuli, or a combination of these. The olfactometer setup records the activity of fly populations responding to odors, and computational analytical methods are applied to quantify fly behaviors. The collected data are analyzed to get a quick read-out of an experimental run, which is essential for efficient data collection and the optimization of experimental conditions.

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

We describe here a behavioral setup and data analysis method for assaying olfactory responses of up to 100 vinegar flies (Drosophila melanogaster). This system may be used with single or multiple olfactory stimuli, and adaptable for optogenetic activation or silencing of neuronal subsets.

Comportements olfactifs dosées par Tracking Computer Of<em&gt; Drosophila</em&gt; Dans un Olfactométre quatre quadrants

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an ...

Single Sensillum Recordings for Locust Palp Sensilla Basiconica

The palps of locust mouthparts are considered to be conventional gustatory organs that play an important role in a locust&#39;s food selection, especially for the detection of non-volatile chemical cues through sensilla chaetica (previously named terminal sensilla or crested sensilla). There is now increasing evidence that these palps also have an olfactory function. An odorant receptor (LmigOR2) and an odorant-binding protein (LmigOBP1) have been localized in the neurons and accessory cells, respectively, in the sensilla basiconica of the palps. Single sensillum recording (SSR) is used for recording the responses of odorant receptor neurons, which is an effective method for screening active ligands on specific odorant receptors. SSR is used in functional studies of odorant receptors in palp sensilla. The structure of the sensilla basiconica located on the dome of the palps differs somewhat from the structure of those on the antennae. Therefore, when performing an SSR elicited by odorants, some specific advice may be helpful for obtaining optimum results. In this paper, a detailed and highly effective protocol for an SSR from insect palp sensilla basiconica is introduced.

This paper describes a detailed and highly effective protocol for single sensillum recordings from the sensilla basiconica on the palps of insect mouthparts.

Sensille unique Recordings pour Locust Palp sensilles basiconiques

The palps of locust mouthparts are considered to be conventional gustatory organs that play an important role in a locust&#39;s food selection, especially ...

Une nouvelle méthode pour une analyse améliorée de l’activité des neurones gustatifs des insectes

Base Recording: A Technique for Analyzing Responses of Taste Neurons in Drosophila

Insects taste the external world through taste hairs, or sensilla, that have pores at their tips. When a sensillum comes into contact with a potential food source, compounds from the food source enter through the pore and activate neurons within. For over 50 years, these responses have been recorded using a technique called tip recording. However, this method has major limitations, including the inability to measure neural activity before or after stimulus contact and the requirement for tastants to be soluble in aqueous solutions. We describe here a technique that we call base recording, which overcomes these limitations. Base recording allows the measurement of taste neuron activity before, during, and after the stimulus. Thus, it allows extensive analysis of OFF responses that occur after a taste stimulus. It can be used to study hydrophobic compounds such as long-chain pheromones that have very low solubility in water. In summary, base recording offers the advantages of single-sensillum electrophysiology as a means of measuring neuronal activity - high spatial and temporal resolution, without the need for genetic tools - and overcomes key limitations of the traditional tip recording technique.

Pleins feux sur l’auteur : Progrès en chimioréception – des récepteurs d’odeurs d’insectes aux ARN non codants

A rarely used method of electrophysiological recording, base recording, allows analysis of features of taste coding that cannot be examined by conventional recording methods. Base recording also allows the analysis of taste responses to hydrophobic stimuli that cannot be studied using traditional electrophysiological methods.

Enregistrement de base : une technique d’analyse des réponses des neurones gustatifs chez la drosophile

Insects taste the external world through taste hairs, or sensilla, that have pores at their tips. When a sensillum comes into contact with a potential ...

Enregistrement électrophysiologique de

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Enregistrements Sensillum simple chez les insectes Drosophila melanogaster Et Anopheles gambiae

Haute résolution de mesure du comportement Odor-Driven dans les larves de drosophile

Imagerie de calcium des odeurs évoquées réponses dans le Drosophila Lobe antennaire

Enregistrement électrophysiologique De

Mesurer les réponses physiologiques de

Haute résolution La quantification du comportement Odor-guidée dans

Méthode électrophysiologique de réponses d'enregistrement intracellulaire tension de

Comportements olfactifs dosées par Tracking Computer Of

Sensille unique Recordings pour Locust Palp sensilles basiconiques

Enregistrement de base : une technique d’analyse des réponses des neurones gustatifs chez la drosophile