Nous remercions M. Helmus pour la voix-off, CM Popelier, S. et C. Levesque Ypenburg pour l&#39;assistance technique. Cette recherche est financée par l&#39;Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NWO), l&#39;Académie royale néerlandaise des arts et des sciences (KNAW) et l&#39;Organisation des services aux étudiants au Japon (JASSO). Cette publication a été financée par une subvention de l&#39;Open Access de NWO à JMK.

1. Elevage installation <ol><li> Obtenir des spécimens adultes d&#39;(L.) de Lymnaea d&#39;une culture de laboratoire comme celui de l&#39;Université VU. </li><li> Maintenir l&#39;eau faible teneur en cuivre à 20 ° C dans la facilité de reproduction (de molluscarium) et bassins expérimentaux, qui ont l&#39;échange continu de l&#39;eau. </li><li> Réglez le cycle lumière / obscurité à 12 h: 12 h. </li><li> Pour l&#39;élevage, nourrir les escargots adultes laitue ad libitum sans pesticides, nourrir les juvéniles avec TetraPhyll (nourriture des poissons) de flocons. Maintenir escargots dans des réservoirs séparés en fonction de leur âge, à partir de masses d&#39;œufs qui sont prévues dans un délai de 24 heures. </li><li> Une fois les escargots sont retirés des bassins d&#39;élevage ne sont pas retournés, pour éviter les effets d&#39;avoir été maintenus dans des conditions légèrement différentes ainsi que pour prévenir pseudoréplication. </li></ol> 2. Dissection <ol><li> Isoler les escargots pendant 1 semaine, et les nourrir ad libitum, d&#39;assurer le that ils ont plein de sperme et le liquide séminal magasins. </li><li> Préparer un microscope stéréo, une plaque de dissection avec des épingles, des petits ciseaux chirurgicaux, pinces fines et grossières, une seringue de 10 ml remplie d&#39;un MgCl2 solution à 50 mM, aiguilles d&#39;injection (0,3 mm x 13 mm) et des serviettes en papier. </li><li> Euthanasier un escargot en injectant MgCl2 solution (généralement 3 ml ou plus pour les escargots adultes avec une longueur de coque de 31,6 ± 2,1 mm et un poids humide de 2,89 ± 0,55 g). Pénétrer dans le pied avec l&#39;aiguille d&#39;injection à un angle de 45 ° et injecter en appuyant légèrement en continu jusqu&#39;à ce que l&#39;escargot se détend et reste étendu (en quelques secondes). Retirez l&#39;aiguille d&#39;injection et vérifier si l&#39;escargot est euthanasié (par exemple, en vérifiant si le réflexe de retrait de tentacule est absent). </li><li> Retirez délicatement la coquille suivant sa courbure à l&#39;aide des pinces grossières. A mi-chemin, détachez le muscle columellaire de la coquille en grattant avec la pince. Tourner doucement til escargot de sa coquille, suivant le sens d&#39;enroulement de la coquille. </li><li> Placez l&#39;escargot sur la plaque de dissection et cerner l&#39;extrémité arrière du pied. Ensuite, placez une épingle à travers la tête et mettre un peu de tension sur l&#39;escargot pour faciliter la dissection. </li><li> Localisez l&#39;gonopore femelle, qui sera plus tard sur un point pour la dissection de référence. </li><li> En utilisant les ciseaux chirurgicaux et des pinces fines, faire la première incision, juste sous le bord du manteau et couper vers le gonopore femelle. Lorsque l&#39;un des lames de ciseaux est poussé les sous la paroi du corps, soulevez doucement pour s&#39;assurer que seule la paroi du corps, et aucun des organes internes, est coupé. Continuer la coupe au-dessus du gonopore vers la tête et couper en ligne droite. </li><li> Localiser la glande de la prostate (postérieure) et les vésicules séminales (antérieures). Disséquer les soigneusement et gardez-les sur de la glace. Les utiliser pour préparer les solutions d&#39;essai contenant un fluide et / ou du sperme séminal. Utilisez physiologique sal Lymnaeaine (5,83 mmol / l de CaCl 2 · 2H 2 O, 3,76 mmol / L de MgCl 2 · 6H 2 O, 42,69 mmol / L de NaCl, 37,53 mmol / L KCl) en tant que milieu de support. </li><li> Recueillir le liquide séminal qui est présent dans la lumière de la glande de la prostate ainsi que le sperme des vésicules séminales. Par la suite, suspendre la fois dans une solution saline dans des flacons séparés en exprimant doucement leur contenu et de retirer le tissu organique avec une pince. Garder sur la glace et utiliser le même jour. Plus tard, mélanger ces suspensions pour créer les différentes solutions de traitement. </li></ol> 3. Intravaginale injection <ol><li> Avant de commencer la procédure d&#39;injection intravaginale, préparer une coquille moule en silicone (fait pour s&#39;adapter à la pointe de la coque), 1 mm seringues, 10-12 tubes cm de silicium d&#39;un diamètre de 1 mm, émoussé aiguilles d&#39;injection (0,3 mm x 13 mm ), une pince grossiers et la même seringue de 10 ml rempli d&#39;une solution mM MgCl 2 50 équipé d&#39;une aiguille d&#39;injection pointue. </li><li> Recueillir le sperme, nécessaire pour ajouter de liquide séminal (ou protéines du liquide séminal individuels) dans certains traitements; une dose biologiquement pertinente est égale à 1/3 d&#39;une glande de la prostate et des vésicules séminales par injection. NOTE: Dans la section des résultats représentatifs (Figure 1) les résultats d&#39;une expérience de trois traitements différents sont présentés: Contrôle (milieu de support, c&#39;est à dire, une solution saline), Ovipostatin (une des protéines du liquide séminal identifiés) seul et Ovipostatin accompagné de sperme. En outre, pour estimer la dose biologiquement pertinente dans d&#39;autres espèces, déterminer la différence de poids de la glande de la prostate de personnes qui ont récemment accouplées et les individus qui sont restés sexuellement isolés 16. </li><li> Préparer seringues de 1 ml de chacune des solutions d&#39;essai préparées. Remplir chaque seringue d&#39;une solution et s&#39;assurer qu&#39;il n&#39;y a pas de bulles d&#39;air à l&#39;intérieur. </li><li> Monter une aiguille d&#39;injection émoussée sur chaque seringue. </li><li> Pour utiliser une injection 1tube de silicium mm de diamètre avec une longueur minimale de 10 cm. </li><li> Faites glisser délicatement le tube de silicium sur l&#39;aiguille d&#39;injection, en veillant à ne pas percer le tube, et retirer l&#39;air du tube en appuyant légèrement la pression sur la seringue. </li><li> Anesthésier un escargot en suivant le même protocole que dans le point 2.3. Cette fois, assurez-vous de ne pas injecter plus de 2-3 ml de 50 mM MgCl 2. </li><li> Poser l&#39;escargot dans la coquille moule à garder dans une position stable. </li><li> Localisez le gonopore femelle, qui est clairement visible, comme une tache blanche sur le côté droit de l&#39;animal, avant à droite tentacule et gonopore mâle (cet endroit est également valable pour d&#39;autres espèces d&#39;escargots d&#39;eau douce). Assurez-vous d&#39;avoir un accès libre. </li><li> Utiliser une pince pour maintenir l&#39;extrémité du tube de silicium et insérer doucement environ 4.2 mm du tube de silicium dans le gonopore femelle. </li><li> Appliquer soigneusement pression à la seringue et d&#39;injecter 0,03 ml de la solution d&#39;essai. Attendre une demi-minute pour permettre à la pression dans le tube de se propager dans le tube femelle avant de retirer le tube. </li><li> Retour de l&#39;escargot traité à son conteneur d&#39;isolement, où il peut être surveillé, et lui permettre de se remettre de la sédation dans le réservoir expérimental. </li></ol> 4. D&#39;essais biologiques <ol><li> Étiqueter chaque escargot pour l&#39;identification et mesurer sa longueur de coque. Ce dernier est un bon indicateur de la taille, ce qui est pertinent pour quantifier la reproduction. </li><li> Gardez chaque escargot isolé dans un ml contenant 460 qui est perforé pour permettre l&#39;échange de l&#39;eau dans le réservoir expérimental. Il est important de placer tous les conteneurs dans la bonne orientation, avec des perforations dans la direction de l&#39;écoulement de l&#39;eau, pour permettre l&#39;échange efficace de l&#39;eau. </li><li> Au cours de l&#39;essai biologique, nourrir les escargots régulièrement avec une quantité standardisée de laitue. Utilisez un tour, perforateur en métal pour couper la laitue. Dans ce protocole, les disques de laitue de 19,6 cm 2 sont utilisés, qui se rapproche de l&#39;uneils peuvent monter au maximum manger en une seule journée. </li><li> Recueillir une masse d&#39;œufs avec le côté plat d&#39;une spatule et racler la masse d&#39;oeufs de la paroi du récipient. Utilisez le côté de la cuillère pour recueillir la masse d&#39;oeufs. NOTE: les masses d&#39;œufs opaques qui viennent d&#39;être fixées ne peuvent être utilisés pour la numérisation (ils deviennent transparents en quelques heures après la pose). Pour les espèces modèles de ce protocole, Lymnaea stagnalis, vérifier des masses d&#39;œufs tous les jours, car ils produisent 2-3 masses d&#39;œufs par semaine. Cela peut varier dans d&#39;autres espèces. </li><li> Balayez les masses d&#39;œufs collectés numériquement à l&#39;aide d&#39;un (ordinateur portable) ordinateur contenant le pilote du scanner, un scanner à plat, une échelle millimétrique standard, une spatule, transférer plaques et carreaux de verre. </li><li> Placez chaque masse d&#39;œufs sur les plaques de transfert et répéter jusqu&#39;à ce que les plaques sont pleins. Par la suite, tamponnez les masses d&#39;œufs sécher sur une serviette en papier et de les transférer sur les carreaux de verre dans le même ordre que sur les plaques de transfert. </li><li> Tournez chaque carreau à l&#39;envers (l&#39;masses d&#39;œufs collent à la tuile de verre) et placer soigneusement sur le scanner à plat, un peu moins de l&#39;échelle millimétrique. Appliquer un peu de pression pour aplatir les masses d&#39;œufs, qui distribue les œufs uniformément de sorte qu&#39;ils sont tous visibles dans le même plan de mise au point. Monter les carreaux avec une quantité standardisée de ruban autour de deux bords pour assurer que tous les oeufs sont aplaties aussi. </li><li> Réglez les paramètres du scanner. Il est important de régler la résolution à son maximum, faire un scan de prévisualisation, recadrer la zone de travail, et de régler la luminosité et le contraste. Balayez les masses d&#39;œufs. </li><li> Placez chaque masse d&#39;oeufs dans sa propre étiquette flacon de 20 ml en verre pour le développement et l&#39;éclosion. </li><li> Rafraîchir l&#39;eau dans des flacons d&#39;incubation tous les jours pour garder correctement oxygéné. Pour ce faire, selon le nombre de nouveau-nés et la taille dans l&#39;ordre suivant: décantation / décanter (pas de nouveau-nés), débordant (début de l&#39;éclosion), et l&#39;extraction hors de l&#39;eau avec une pipette (de nombreux nouveau-nés). </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 5. Mesure et de comptage des oeufs <ol><li> Installez le ImageJ logiciel d&#39;analyse d&#39;image librement disponible (NIH, USA) et le compteur de cellules plugin. </li><li> Ouvrir ImageJ ainsi que d&#39;un tableur pour transférer les données. Ensuite, ouvrez une image scannée de masses d&#39;œufs dans ImageJ. </li><li> Réglez l&#39;échelle à l&#39;aide de l&#39;outil de zoom pour naviguer à l&#39;échelle millimétrique. Zoomer et ajuster la fenêtre de 1 mm pour remplir l&#39;écran. Tracez une ligne en utilisant l&#39;outil de ligne de démarcation entre les deux lignes qui indiquent 1 mm. Accédez à analyser, et Set échelle. Dans le menu pop-up de l&#39;option de mesure de longueur devient visible, ajuster la distance connu à 1 et l&#39;unité de longueur de mm. Cochez la case mondial, et fermer la fenêtre. </li><li> Définissez les mesures privilégiées (longueur, largeur, circonférence) en accédant à analyser, et Set mesures en sélectionnant régionaux et le diamètre de Feret (longueur et largeur). Cliquez sur OK pour confirmer et continuer avec l&#39;analyse de l&#39;image. </li><li> Pour mesurer les oeufs, zoom sur un oeuf dans de la première masse d&#39;oeuf qui doit être mesuré. Un zoom de 800% est recommandé. Puis, en utilisant l&#39;outil elliptique dessiner un ovale exactement autour de l&#39;oeuf, appuyez sur CTRL + D pour dessiner la circonférence sur l&#39;image (pour empêcher la mesure de la même œuf deux fois). Ensuite, appuyez sur Ctrl + M pour enregistrer la mesure des propriétés de l&#39;ovale (longueur, largeur, circonférence); un écran pop-up s&#39;ouvre et affiche les mesures. NOTE: L&#39;utilisation de l&#39;outil elliptique pour mesurer les oeufs ne s&#39;applique pas à toutes les espèces. Pour les espèces aux oeufs en forme de manière non uniforme, utiliser les sélections à main levée à la place. </li><li> Mesurer autant d&#39;œufs que nécessaires, puis enregistrer les mesures. Xls feuille de calcul. Eventuellement, copier les données directement dans une feuille de calcul. </li><li> Par la suite compter les œufs dans une masse d&#39;œufs, à l&#39;aide de la fenêtre du compteur et de mettre les chiffres manuellement dans la feuille de calcul. </li><li> Sinon, compter les œufs individuels par la masse des oeufs à l&#39;aide de la cellule contre le plug-in. Pour cela, accédez à des plug-ins,alors, analyser et sélectionner portable compteur. La fenêtre du compteur de cellule s&#39;affiche, cochez la case &quot;garder originale&quot; boîte et appuyez sur &quot;initialiser&quot;. Une nouvelle fenêtre du compteur apparaît, sélectionnez l&#39;outil en forme de croix de la barre d&#39;outils et sélectionnez un type de compteur dans le menu de compteur de cellules. Compter les œufs individuels en cliquant sur les œufs individuels dans la fenêtre du compteur de cellule. Observer le nombre total en regard du type de compteur dans le menu de compteur de cellules. Copiez ce numéro manuellement à une feuille de calcul ou d&#39;obtenir les résultats en appuyant sur les résultats. </li><li> Comptez plusieurs masses d&#39;œufs dans un événement de comptage en ajoutant types de compteurs, si nécessaire. </li></ol>

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Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Le protocole présenté montre comment recueillir le liquide séminal et comment tester ce d&#39;une manière biologiquement significative. Bien que cette procédure est représenté ici à l&#39;aide de l&#39;extrait de la glande de la prostate, l&#39;effet d&#39;une seule protéine purifiée liquide séminal peut également être testée en suivant la même procédure. Évidemment, dans ces tests, il est toujours crucial d&#39;inclure des contrôles appropriés (traitements fictifs) de veiller à ce que la procédure et / ou le moyen de transport n&#39;affectent pas les paramètres en question 14,16. En utilisant ce procédé, il a déjà été montré qu&#39;il existe une seule protéine de liquide séminal, à savoir Ovipostatin, qui médie une réduction de la ponte 14,16. Cette protéine, produite dans la glande de la prostate et transféré au cours de l&#39;accouplement avec les spermatozoïdes, représente le premier composant liquide séminal entièrement caractérisé par un hermaphrodite simultané et n&#39;a, jusqu&#39;à présent, ne montre aucune ressemblance avec des protéines connues. La constatation que Ovipostaétain réduit la production de masse d&#39;oeufs dans le récipient corrobore les travaux antérieurs indiquant que les substances dans le sperme peuvent influencer la ponte 13-15. En transférant biologiquement montants concernés (voir 3.2 16), on peut démontrer de façon convaincante que c&#39;est une protéine liquide séminal, et non la présence de spermatozoïdes eux-mêmes, qui intervient dans la réduction observée de la ponte (Figure 1). Étant donné que la réception répétée de liquide séminal par croisements naturels augmente l&#39;investissement par oeuf 15, il devient maintenant très pertinent pour quantifier d&#39;autres paramètres de la ponte. Le protocole présenté fournit maintenant les méthodes nécessaires pour le faire. Bien qu&#39;aucun effet n&#39;a été trouvée de Ovipostatin sur le succès des œufs pondus par le destinataire 16 à couver, il peut y avoir d&#39;autres protéines du liquide séminal qui agissent de concert avec cette protéine. Par conséquent, les paramètres qui doivent être quantifiés dans ce contexte - à côté de la pose nombre de fréquences et des œufs - comprennent la taille des œufs, hatctemps hing, le développement des nouveau-nés et la taille des nouveau-nés. En outre, il est possible d&#39;examiner les effets sur d&#39;autres processus femmes que la ponte, telles que le stockage de sperme et l&#39;utilisation, ainsi que l&#39;allocation des ressources vers la fonction de reproduction mâle et femelle 14,17. De toute évidence, la méthode présentée est instrumentale dans la résolution de ces questions suivi, à la fois dans Lymnaea stagnalis et dans d&#39;autres escargots d&#39;eau douce. En somme, les expériences utilisant ce protocole montrent que les protéines transférées liquide séminal affectent la performance de reproduction féminin du bénéficiaire dans ces hermaphrodites simultanés. Étant donné que peu d&#39;études ont abordé ce, il est susceptible d&#39;être beaucoup plus fréquent dans la fertilisation interne hermaphrodites que actuellement reflété dans la littérature scientifique. Surtout quand on sait que le choix du partenaire pré-copulation et de la concurrence de sperme ont été montré à jouer un rôle important dans ces hermaphrodites 14, qui highlights le potentiel de ces protéines mâles de la glande accessoire à être sélectionné sexuellement dans ce système. Enfin, cette recherche contribue à soutenir le développement de la notion que les protéines du liquide séminal sont d&#39;égale importance pour hermaphrodites simultanés car ils sont des espèces distinctes-sexué.

Lors du transfert, les spermatozoïdes sont habituellement accompagné par le liquide séminal produit par les glandes accessoires mâles. Alors que certains composants éjaculat jouent un rôle dans l&#39;activation de sperme nourrissante et 1, d&#39;autres influencent la physiologie féminine en vue d&#39;accroître le succès de la fécondation du donneur de sperme 2-4. Ces effets sont particulièrement choisis pour, par la sélection sexuelle, quand une espèce est très promiscuité et a de stockage de sperme et le sperme efficace digestion. Dans ces conditions, les donneurs de sperme concurrence fortement pour la fécondation des œufs 5. Bien qu&#39;il existe des preuves abondantes de corrélation de l&#39;importance des substances liquide séminal pour le succès de la fécondation mâle, la preuve directe est plus rare et peu d&#39;études ont puisé dans les détails de la modification et / ou substances impliquées 6 physiologique. Chez les espèces à sexes séparés (c&#39;est à dire, hommes et femmes; gonochorists) il ya un peu modèle spéci bien étudiées quand il s&#39;agit de la composition de fluide séminal et de leurs effets. Les exemples incluent la mouche des fruits, Drosophila melanogaster 6, le moustique vecteur du paludisme, Anopheles gambiae 7, et le coléoptère rouge de la farine, Tribolium castaneum 8. Ces études liquide séminal sont beaucoup plus rares quand il s&#39;agit pour les espèces qui sont en même temps hermaphrodite (c&#39;est à dire, les individus sont fonctionnellement mâles et femelles en même temps), même si ce mode de reproduction est courante dans le règne animal 9. L&#39;exemple le plus notable hermaphrodite du transfert d&#39;une substance de la glande accessoire est probablement la prise de vue de ce qu&#39;on appelle l&#39;amour-fléchettes dans les escargots terrestres 2,10, où la substance est transférée par le donneur de sperme par injection hypodermique 11,12, c&#39;est-à-pas avec les spermatozoïdes. Mais il ya beaucoup hermaphrodites simultanés qui transfèrent mâles produits de la glande accessoire avec leur sperme,tels que les espèces modèles utilisés ici, le grand étang Lymnaea stagnalis. Des recherches antérieures ont déjà démontré que la réception du liquide séminal influe sur la capacité reproductrice femelle de cette espèce 13-15, et plusieurs des protéines du liquide séminal impliqués ont été identifiés 16,17. L&#39;objectif global de ce protocole, qui est une extension des méthodes présentées dans Koene et al 16, est de tester les effets des protéines du liquide séminal sur les différents paramètres de la ponte dans les mollusques gastéropodes. Ceci est accompli par la dissection de la glande de la prostate (par exemple, la glande accessoire mâle produire le liquide séminal) des escargots sexuellement isolé à partir d&#39;une culture de laboratoire normalisé donateurs. Deuxièmement, le sperme du donneur est collecté à partir des vésicules séminales et des solutions de traitement différents sont faits. Par la suite, les escargots d&#39;essai sont anesthésiés par voie intravaginale et injectés avec une solution d&#39;essai (par exemple,extrait de glande prostate seul, extrait de glande prostate avec le sperme, le sperme seul, moyen de support seul). Ces escargots de test sont ensuite suivis pendant les jours suivants à quelques semaines, dans des conditions standard, pour enregistrer la ponte. Les masses d&#39;œufs sont collectés, numériquement, pour compter et mesurer les différents paramètres, et ensuite mis dans des flacons individuels à couver. Après environ deux semaines, les nouveau-nés sont comptés et numériquement analysés. Toutes les analyses, de deux masses d&#39;œufs et les nouveau-nés, sont ensuite analysées à l&#39;aide d&#39;un logiciel d&#39;analyse d&#39;images librement disponibles. Pour ce protocole la souche de laboratoire de la grande escargot étang, Lymnaea stagnalis, est utilisé, ce qui est élevé à l&#39;Université VU d&#39;Amsterdam. Cette espèce constitue un système modèle pour étudier des questions sur la sélection sexuelle et de la reproduction dans les hermaphrodites. Relativement grande taille de l&#39;animal, il est expérimentalement très accessible. En outre, parce qu&#39;il est utilisé comme espèce modèle dans de nombreux bdisciplines siologiques nous savons déjà beaucoup sur la biologie de base de ces animaux. Cette méthode permettra d&#39;étudier les questions relatives aux processus de sélection sexuelle qui sont médiés par des protéines du liquide séminal en général. En outre, parce que ce sont hermaphrodites simultanés, il est possible d&#39;indiquer si ces protéines agissent de manière similaire et / ou différentes comme c&#39;est le cas dans les espèces où les sexes sont séparés 16,17.

<table><tbody><tr><td>Fish food flakes</td><td>TetraPhyll</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Small surgical scissors</td><td>WPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coarse and fine forceps</td><td>WPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml syringe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Injection needles (0.3 mm x 13 mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5.83 mmol/L CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#183;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3.76 mmol/L MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#183;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>42.69 mmol/L NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37.53 mmol/L KCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Two component Silicon</td><td>Sylgard</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mm syringes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silicon tubing (diameter 1 mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blunted injection needles (0.3 mm x 13 mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubes</td><td>Eppendorff</td><td></td><td></td></tr><tr><td>460 ml perforated containers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metal leaf puncher (19.6 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spatula/spoon</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Laptop) computer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flatbed scanner</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millimeter scale</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transferring plates</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass tiles</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 ml glass vials</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

effect of male accessory gland products on egg laying in gastropod molluscs

Dans la fertilisation interne animaux, le liquide séminal est habituellement ajouté aux spermatozoïdes, formant ensemble le sperme ou éjaculat. Outre l&#39;activation de sperme et nourrissante, les composants dans le liquide séminal peut également influencer la physiologie féminine pour augmenter le succès de la fécondation du donneur de sperme. Alors que de nombreuses études ont rapporté ces effets chez les espèces à sexes séparés, peu d&#39;études ont abordé cette chez les animaux hermaphrodites simultanément. Ce protocole vidéo présente une méthode pour étudier les effets de liquide séminal chez les gastéropodes, en utilisant un escargot d&#39;eau douce en même temps hermaphrodite, le grand escargot étang Lymnaea stagnalis, comme organisme modèle. Alors que la procédure est représenté en utilisant des extraits complets de la glande de la prostate, les composants individuels (à savoir, des protéines, des peptides, et d&#39;autres composés) du liquide séminal peuvent être testés de la même manière. Effets de la réception de composants éjaculer sur la ponte peuvent être quantifiés en termes de fréquence de ponte etestimations les plus subtiles de la performance de reproduction des femmes telles que les numéros d&#39;oeuf dans chacune des masses d&#39;œufs. Les résultats montrent que les protéines du liquide séminal affectent la reproduction des femmes dans ce hermaphrodite simultané, en soulignant leur importance pour la sélection sexuelle.

La figure 1 montre le pourcentage d&#39;animaux pondent des œufs après l&#39;injection intra-vaginale ou l&#39;autre de la substance témoin (solution saline), Ovipostatin, ou Ovipostatin accompagnés de sperme. N = 15 pour chaque traitement; voir Koene et al 16 pour plus de détails et des statistiques (Source: Figure 3 de Koene et al 2010, la revue PLoS ONE.).. <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51698/51698fig1highres.jpg" width="500" /> Figure 1. Effet de Ovipostatin sur la production d&#39;oeufs de masse de Lymnaea stagnalis. Le graphique montre le pourcentage d&#39;animaux pondent des œufs après l&#39;injection intravaginale soit la substance de contrôle (saline), Ovipostatin, ou Ovipostatin accompagnés de sperme. N = 15 pour chaque traitement; voir Koene et al. 2010 Détails et statistiques. Réimpression avec la permission de Koene et al 2010 PLoS ONE 5:. E10117.

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Effect of Male Accessory Gland Products on Egg Laying in Gastropod Molluscs

This video protocol demonstrates a method to study effects of seminal fluid in gastropods, using the hermaphroditic freshwater snail Lymnaea stagnalis.

Effet de la Femme accessoire Gland produits sur la ponte dans les gastéropodes

In internally fertilizing animals, seminal fluid is usually added to the spermatozoa, together forming the semen or ejaculate. Besides nourishing and ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

10.6K vues.  VU University. This video protocol demonstrates a method to study effects of seminal fluid in gastropods, using the hermaphroditic freshwater snail Lymnaea stagnalis.

Vidéo: Effect of Male Accessory Gland Products on Egg Laying in Gastropod Molluscs

A Noninvasive Method For In situ Determination of Mating Success in Female American Lobsters (Homarus americanus)

Despite being one of the most productive fisheries in the Northwest Atlantic, much remains unknown about the natural reproductive dynamics of American lobsters. Recent work in exploited crustacean populations (crabs and lobsters) suggests that there are circumstances where mature females are unable to achieve their full reproductive potential due to sperm limitation. To examine this possibility in different regions of the American lobster fishery, a reliable and noninvasive method was developed for sampling large numbers of female lobsters at sea. This method involves inserting a blunt-tipped needle into the female&#39;s seminal receptacle to determine the presence or absence of a sperm plug and to withdraw a sample that can be examined for the presence of sperm. A series of control studies were conducted at the dock and in the laboratory to test the reliability of this technique. These efforts entailed sampling 294 female lobsters to confirm that the presence of a sperm plug was a reliable indicator of sperm within the receptacle and thus, mating. This paper details the methodology and the results obtained from a subset of the total females sampled. Of the 230 female lobsters sampled from George&#39;s Bank and Cape Ann, MA (size range = 71-145 mm in carapace length), 90.3% were positive for sperm. Potential explanations for the absence of sperm in some females include: immaturity (lack of physiological maturity), breakdown of the sperm plug after being used to fertilize a clutch of eggs, and lack of mating activity. The surveys indicate that this technique for examining the mating success of female lobsters is a reliable proxy that can be used in the field to document reproductive activity in natural populations.

A Noninvasive Method For In situ Determination of Mating Success in Female American Lobsters Homarus americanus

Fishery-induced changes to exploited crustacean fisheries, such as the American lobster fishery, could potentially influence their reproductive dynamics, leading to a reduction in mating success. This study&#39;s goal was to develop a noninvasive method for ascertaining the mating success of female lobsters that may be physiologically or functionally mature.

Une méthode non invasive pour<em&gt; In situ</em&gt; Détermination du succès de l&#39;accouplement chez les femelles homards américains (<em&gt; Homarus americanus</em&gt;)

Despite being one of the most productive fisheries in the Northwest Atlantic, much remains unknown about the natural reproductive dynamics of American ...

Recherche

Environnement

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

Obtention des oeufs de Xenopus laevis femelles

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Biologie

Mechanical Separation and Protein Solubilization of the Outer and Inner Perivitelline Sublayers from Hen's Eggs

The perivitelline layer that surrounds the egg yolk plays a fundamental role in fertilization, in egg defense, and in the development of the avian embryo. It is formed by two proteinaceous sublayers that are tightly associated and formed by distinct female reproductive organs. Both structures are assumed to have their own functional specificities, which remain to be defined. To characterize the function of proteins composing each sublayer, the first challenge is to establish the conditions that would allow for the mechanical separation of these two intricate layers, while limiting any structural damage. The second step is to optimize the experimental conditions to facilitate protein solubilization from these two sublayers, for subsequent biochemical analyses. The efficiency of this approach is assessed by analyzing the protein profile of each sublayer by Sodium Dodecyl Sulfate-Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE), which is expected to be distinct between the two structures. This two-step procedure remains simple; it requires classical biochemical equipment and reagents; and is compatible with further in-depth proteomics. It may also be transposed to other avian eggs for comparative biology, knowing that the structure and the composition of the perivitelline layer has been shown to have species-specific features. In addition, the non-denaturing conditions developed for sublayers separation (step 1) allow their structural analyses by scanning and transmission electron microscopy. It may also constitute the initial step for subsequent protein purification to analyze their respective biological activities and 3D structure, or to perform further immunohistochemical or functional analyses. Such studies would help to decipher the physiological function of these two sublayers, whose structural and functional integrities are determinant criteria of the reproductive success.

This article reports a simple method to isolate the outer and inner perivitelline sublayers of chicken eggs while minimizing structural alteration and to optimize protein solubilization of each sublayer for proteomic analyses.

Séparation mécanique et solubilisation protéique des sous-couches périphériques extérieures et intérieures des œufs de poule

The perivitelline layer that surrounds the egg yolk plays a fundamental role in fertilization, in egg defense, and in the development of the avian embryo. ...

Biochimie

Analysis of Transforming Growth Factor &#223; Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos

The two arms of the Transforming Growth Factor &#223; (Tgf&#223;) superfamily, represented by Tgf&#223;/Nodal or Bone morphogenetic protein (Bmp) ligands, respectively, play essential roles in embryonic development and adult homeostasis. Members of the Tgf&#223; family are made as inactive precursors that dimerize and fold within the endoplasmic reticulum. The precursor is subsequently cleaved into ligand and prodomain fragments. Although only the dimeric ligand can engage Tgf&#223; receptors and activate downstream signaling, there is growing recognition that the prodomain moiety contributes to ligand activity. This article describes a protocol that can be used to identify cleavage products generated during activation of Tgf&#223; precursor proteins. RNA encoding Tgf&#223; precursors are first microinjected into X. laevis embryos. The following day, cleavage products are collected from the blastocoele of&#160;gastrula stage embryos and analyzed on Western blots. This protocol can be completed relatively quickly, does not require expensive reagents and provides a source of concentrated Tgf&#223; cleavage products under physiologic conditions.

Analysis of Transforming Growth Factor &#223; Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos

When Transforming Growth Factor &#223; family precursor proteins are ectopically expressed in Xenopus laevis embryos, they dimerize, get cleaved and are secreted into the blastocoele, which begins at the late blastula to early gastrula stage. We describe a method for aspirating cleavage products from the blastocoele cavity for immunoblot analysis.

Analyse du facteur de croissance transformant ß Produits de clivage de la famille sécrétés en blastocoèles d’embryons xenopus laevis

The two arms of the Transforming Growth Factor &#223; (Tgf&#223;) superfamily, represented by Tgf&#223;/Nodal or Bone morphogenetic protein (Bmp) ligands, ...

Biologie du développement

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. When selecting sites to deposit their eggs, female flies are capable of ranking the relative attractiveness of their options and choosing the &#34;greater of two goods.&#34; However, most egg-laying preference assays are not practical if one wants to take a systematic genetic screening approach to search for the circuit basis underlying this simple decision-making process, as they are population-based and laborious to set up. To increase the throughput of studying of egg-laying preferences of single females, we developed custom chambers that each can simultaneously assay egg-laying preferences of up to thirty individual flies as well as a protocol that ensures each female has a high egg-laying rate (so that their preference is readily discernable and more convincing). Our approach is simple to execute and produces very consistent results. Additionally, these chambers can be equipped with different attachments to allow video recording the egg-laying animals and to deliver light for optogenetics studies. This article provides the blueprints for fabricating these chambers and the procedure for preparing the flies to be assayed in these chambers.

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

This protocol describes a high throughput assay for testing egg-laying preferences of Drosophila melanogaster at single-animal resolution. This assay provides a simple, efficient, and scalable platform to identify genes and circuit components that control a simple decision-making process.

High Throughput Assay pour examiner les préférences de ponte de l&#39;individu<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. ...

Neurosciences

Two Types of Assays for Detecting Frog Sperm Chemoattraction

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension and microscopically visualize sperm accumulation around the pipette1. Sperm chemoattraction in vertebrates such as frogs, rodents and humans is more difficult to detect and requires quantitative assays. Such assays are of two major types - assays that quantitate sperm movement to a source of chemoattractant, so-called sperm accumulation assays, and assays that actually track the swimming trajectories of individual sperm.
Sperm accumulation assays are relatively rapid allowing tens or hundreds of assays to be done in a single day, thereby allowing dose response curves and time courses to be carried out relatively rapidly. These types of assays have been used extensively to characterize many well established chemoattraction systems - for example, neutrophil chemotaxis to bacterial peptides and sperm chemotaxis to follicular fluid. Sperm tracking assays can be more labor intensive but offer additional data on how chemoattractancts actually alter the swimming paths that sperm take. This type of assay is needed to demonstrate the orientation of sperm movement relative to the chemoattrractant gradient axis and to visualize characteristic turns or changes in orientation that bring the sperm closer to the egg.
Here we describe methods used for each of these two types of assays. The sperm accumulation assay utilized is called a "two-chamber" assay. Amphibian sperm are placed in a tissue culture plate insert with a polycarbonate filter floor having 12 &mu;m diameter pores. Inserts with sperm are placed into tissue culture plate wells containing buffer and a chemoatttractant carefully pipetted into the bottom well where the floor meets the wall (see Fig. 1). After incubation, the top insert containing the sperm reservoir is carefully removed, and sperm in the bottom chamber that have passed through the membrane are removed, pelleted and then counted by hemocytometer or flow cytometer.
The sperm tracking assay utilizes a Zigmond chamber originally developed for observing neutrophil chemotaxis and modified for observation of sperm by Giojalas and coworkers2,3. The chamber consists of a thick glass slide into which two vertical troughs have been machined. These are separated by a 1 mm wide observation platform. After application of a cover glass, sperm are loaded into one trough, the chemoattractant agent into the other and movement of individual sperm visualized by video microscopy. Video footage is then analyzed using software to identify two-dimensional cell movements in the x-y plane as a function of time (xyt data sets) that form the trajectory of each sperm.

Eggs and the extracellular coatings around eggs frequently release peptides, proteins and small molecules that communicate with sperm to guide them to the egg thereby promoting fertilization. Using frog sperm we describe and compare two classes of assays used to detect sperm chemoattraction &#x2013; sperm accumulation assays and sperm tracking assays.

Deux types de tests pour la chimio-attraction Frog sperme Détection

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension ...

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a &#39;whole mount&#39; tissue preparation, or developmental stage (such as an embryo or larva) of interest. WMISH is extremely powerful because it can significantly contribute to the functional characterization of complex metazoan genomes, a challenge that is becoming more of a bottleneck with the deluge of next generation sequence data. Despite the conceptual simplicity of the technique much time is often needed to optimize the various parameters inherent to WMISH experiments for novel model systems; subtle differences in the cellular and biochemical properties between tissue types and developmental stages mean that a single WMISH method may not be appropriate for all situations. We have developed a set of WMISH methods for the re-emerging gastropod model Lymnaea stagnalis that generate consistent and clear WMISH signals for a range of genes, and across all developmental stages. These methods include the assignment of larvae of unknown chronological age to an ontogenetic window, the efficient removal of embryos and larvae from their egg capsules, the application of an appropriate Proteinase-K treatment for each ontogenetic window, and hybridization, post-hybridization and immunodetection steps. These methods provide a foundation from which the resulting signal for a given RNA transcript can be further refined with probe specific adjustments (primarily probe concentration and hybridization temperature).

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

The goal of this protocol is to provide users with a set of methods for the high-throughput decapsulation of Lymnaea stagnalis embryos and larvae in preparation for whole mount in situ hybridization, and for subsequent pre- and post-hybridization treatments.

A Mont entier<em&gt; In Situ</em&gt; Méthode Hybridation pour le mollusque gastéropode<em&gt; Lymnaea stagnalis</em

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a ...

Standardizing a Non-Lethal Method for Characterizing the Reproductive Status and Larval Development of Freshwater Mussels (Bivalvia: Unionida)

Actively monitoring the timing, development, and reproductive patterns of endangered species is critical when managing for population recovery. Freshwater mussels are among the most imperiled organisms in the world, but information about early larval (glochidial) development and brooding periods is still lacking for many species. Previous studies have focused on the complex life history stage when female mussels are ready to parasitize host fish, but few studies have focused on the brooding period and timing of larval development. The protocol described here allows researchers to non-lethally evaluate the state of gravidity for female mussels. The results of this study show that this method does not affect a female mussel&rsquo;s ability to stay gravid or become gravid again after sampling has been performed. The advantage of this method may permit its use on federally threatened or endangered species or other populations of high conservation concern. This protocol can be adapted for use on both preserved or live individuals and was tested on a variety of mussel species. The database provided is a repository for a breadth of information on timing of reproductive habits and will facilitate future freshwater mussel research, conservation, and recovery efforts.

Standardizing a Non-Lethal Method for Characterizing the Reproductive Status and Larval Development of Freshwater Mussels Bivalvia: Unionida

Freshwater mussel conservation is dependent on monitoring reproductive patterns and processes of species. This study standardizes a non-lethal protocol for sampling gill contents, characterizing larval development, and providing a digital repository for data collected. This protocol-database package will be an important tool for mussel researchers in recovery of imperiled species.

Normalisation d'une méthode non létale pour caractériser l'état reproducteur et le développement larvaire des moules d'eau douce (Bivalvia: Unionida)

Actively monitoring the timing, development, and reproductive patterns of endangered species is critical when managing for population recovery. Freshwater ...

Eyestalk Ablation to Increase Ovarian Maturation in Mud Crabs

Mud crabs (Scylla spp.) are commercially important crustacean species that can be found throughout the Indo-West Pacific region. During culture, the induction of ovarian maturation is important to meet the consumer demand for mature mud crabs and hasten seed production. Eyestalk ablation is an effective tool to enhance ovarian maturation in mud crabs. However, there is no standard protocol for the eyestalk ablation of mud crabs. In this study, two eyestalk ablation techniques are described: cauterization (the use of hot metal to ablate the eyestalk of an anesthetized crab) and surgery (the removal of the eyestalk using surgical scissors). Before eyestalk ablation, sexually mature females (CW &#62; 86 mm) were anesthetized using an ice bag (&#8722;20 &#176;C) with seawater. When the water temperature reached 4 &#176;C, the ice bag was removed from the water. Flowing seawater (ambient temperature: 28 &#176;C) was used for recovery from the anesthesia immediately after eyestalk ablation. Mortality did not occur during or after the process of eyestalk ablation. The eyestalk ablation protocol presented here accelerated the ovarian maturation of the mud crabs.

Two eyestalk ablation protocols (i.e., cauterization and surgery&#160;approaches) were performed on anesthetized female crabs. The eyestalk ablation of mud crabs hastened the ripening of ovaries without decreasing the survival rate.

Ablation de la tige oculaire pour augmenter la maturation ovarienne chez les crabes de vase

Mud crabs (Scylla spp.) are commercially important crustacean species that can be found throughout the Indo-West Pacific region. During culture, the ...

Drosophila Male Accessory Gland Dissection: A Method to Isolate Secondary Cells

Source: Immarigeon, C., et al. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/video/60218/" target="_blank">A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands</a>. J. Vis. Exp. (2019).
This video describes the dissection of the accessory glands from male flies and shows an example in which the isolated gland will be dissociated into a single cell suspension.

drosophile Dissection de glande accessoire mâle : une méthode pour isoler des cellules secondaires

Source: Immarigeon, C., et al. A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands. J. Vis. Exp. (2019).
...

Effet de la Femme accessoire Gland produits sur la ponte dans les gastéropodes

Résumé

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Une méthode non invasive pour