Esta investigación tiene como objetivo obtener información sobre las proteínas sin marcadores a nivel de molécula única en tiempo real, con un enfoque particular en las proteínas que son difíciles de investigar con las técnicas actuales o que tienen relevancia para la enfermedad. Las nanopinzas plasmónicas han demostrado recientemente su capacidad para monitorear la dinámica conformacional al unirse a moléculas pequeñas, verificar la cinética de desensamblaje y dilucidar paisajes de energía libre, todo a nivel de una sola molécula. En la actualidad, ninguna técnica de caracterización de proteínas establecida es capaz de investigar la dinámica conformacional de proteínas de una sola molécula sin marcadores.
Se cree que las nanopinzas plasmónicas tienen el potencial de llenar este nicho dentro del campo. Esta ventaja única nos ayuda a investigar la relación entre el cambio conformacional de las proteínas y sus funciones biológicas y las implicaciones en el desarrollo de enfermedades. Las investigaciones futuras se centrarán en las proteínas intrínsecamente desordenadas y de membrana, ya que muchas de ellas están implicadas en varias enfermedades como el Alzheimer, el Parkinson y varios tipos de cáncer.
Para empezar, coloque la muestra recubierta de PEG-tiol en la celda de flujo impresa en 3D con pinzas rectas, asegurándose de que la capa de oro mire hacia arriba. Despegue un lado de la cubierta de cinta adhesiva transparente de plástico PET de doble cara. Coloque con cuidado la cinta sobre la muestra y la celda de flujo, asegurándose de que las nanoestructuras y los orificios de entrada/salida de la celda de flujo permanezcan descubiertos.
Con pinzas redondeadas, presione suavemente alrededor de los bordes de la cinta para asegurar su adhesión a la celda de flujo y a la muestra. Despegue el otro lado de la cinta y coloque suavemente una cubierta de vidrio sobre la muestra. Use pinzas redondeadas para presionar alrededor de los bordes del cubreobjetos para asegurar su adherencia.
Este proceso crea un canal de líquido dentro de la celda de flujo con una altura de 50 micrómetros y un volumen de 3,5 microlitros. Con una punta de pipeta pequeña, mezcle partes iguales de la solución A y la solución B de la silicona duplicada en un portaobjetos de microscopio en una proporción de uno a uno o según lo especificado por el fabricante. Rellene los espacios entre el cubreobjetos y la celda de flujo con una silicona duplicada mezclada, empujándola suavemente debajo del cubreobjetos.
Sostenga la celda de flujo boca abajo y aplique con cuidado silicona duplicada alrededor de la pared interior del orificio. Mueva suavemente la silicona sobre los bordes visibles de la parte inferior de la sílice fundida de la muestra, dejando que la muestra se seque con la capa de oro hacia arriba hasta que la silicona duplicada se haya fraguado por completo. Después de verificar que todos los componentes estén conectados correctamente, cargue la interfaz de usuario del sistema microfluídico en la computadora.
Haga clic en el icono de reproducción junto al distribuidor y el cable MUX, que controlan la válvula rotativa de 12 por una y la válvula de tres por dos vías respectivamente para abrir sus interfaces correspondientes. Para evitar la válvula de tres por dos vías, abra el puerto uno del cable. Para montar la celda de flujo en nanotpinzas plasmónicas, conecte los tubos de entrada y salida a las partes apropiadas de la celda de flujo.
Coloque la celda de flujo sobre un pañuelo limpio con la capa de oro hacia arriba. Infunda tampón en la celda de flujo a un caudal alto de aproximadamente 0,3 mililitros por minuto. Compruebe que el fluido se mueva a través de la muestra dentro de la celda de flujo y que no haya fluido visible en el exterior o en la parte inferior.
Aplique una o dos gotas de aceite de inmersión sobre el objetivo 100X. Coloque la celda de flujo en la etapa de nanotpinas plasmónicas con la capa de oro hacia abajo. Asegure la celda de flujo con clips de metal sobre los imanes y bloquee la etapa para mantenerla en su lugar.
Encienda la fuente de luz blanca. Abra el software de la cámara y ajuste el tiempo de exposición y la ganancia hasta que las nanoestructuras se vuelvan visibles. Encienda el láser a una potencia relativamente alta y ajuste manualmente el eje Z hasta que el punto láser sea visible.
Encienda el controlador piezoeléctrico y seleccione la configuración adecuada para el puerto de comunicación y el voltaje máximo. Establezca los valores de los ejes X, Y y Z a la mitad del voltaje máximo para permitir una mejor alineación de la etapa en todas las direcciones. Alinee el punto láser con una de las estructuras de doble nanoorificio o DNH utilizando las perillas de control de los ejes X, Y y Z de la etapa principal.
Asegúrese de que el fotodiodo de avalancha o APD esté encendido. Cierre suavemente la carcasa a las nanotpinas plasmónicas. Abra el software asociado con la grabación de APD, como una interfaz de usuario de LabVIEW casera. Edite el nombre del archivo y establezca la frecuencia de corte en un kilohercio.
A continuación, especifique la ruta de archivo deseada donde se guardarán los archivos. Apague la fuente de luz blanca y vuelva a encender el láser. Después de ajustar la potencia del láser a un nivel adecuado, utilice los controles piezoeléctricos para ajustar los ejes X, Y y Z hasta que la señal APD sea lo más alta posible.
Evitando la saturación de APD y con una desviación estándar mínima de la traza. A continuación, apague el láser para preservar la vida útil de las nanoestructuras. Haga funcionar la unidad de control de la bomba de jeringa y la interfaz de usuario del distribuidor para configurar la válvula y extraer la cantidad deseada de proteína.
Usando la interfaz de usuario microfluídica, infunda la solución de proteína a una velocidad de flujo similar a la tasa de extracción. Continúe la infusión a este ritmo hasta que la solución proteica llegue a la celda de flujo. A continuación, ajuste el caudal a un valor adecuado para el reventado y espere a que se estabilice la traza.
Verifique que el volumen y el tiempo en la bomba de jeringa coincidan con los valores esperados. Para registrar los datos de la señal APD, ajuste los ejes X, Y y Z según sea necesario mediante la interfaz de usuario del controlador piezoeléctrico. Al observar un gran cambio en la transmisión y la desviación estándar, anote el momento en que esto ocurre para la clasificación de datos futura. Si es necesario liberar la proteína como parte del experimento, apague el láser durante aproximadamente cinco segundos y luego vuelva a encenderlo.
La traza debe tener un cambio grande en la transmisión y una desviación estándar significativamente menor, lo que indica un retorno al estado de referencia. Después de completar el experimento, apague el láser. Retire la celda de flujo de la etapa de tres ejes y desconecte la tubería del sistema microfluídico.
Coloque la celda de flujo sobre un pañuelo limpio con la capa de oro hacia arriba. Con un bisturí, corte con cuidado el pegamento debajo del engobe de la cubierta de vidrio antes de levantarlo suavemente y desecharlo. Sostenga la celda de flujo en ángulo con la capa de oro aún hacia arriba y use pinzas redondeadas para quitar con cuidado el pegamento de la parte inferior de la celda de flujo para liberar la muestra.
Con unas pinzas rectas, recoja la muestra y enjuáguela bien con isopropanol. Seque la muestra con una pistola de aire. Un experimento representativo llevado a cabo sobre la carga de hierro in situ en una molécula de apoferritina demuestra el uso de nanotweezers plasmónicas como herramienta para investigar la dinámica conformacional de las proteínas.
La traza de transmisión de la apoferritina permanece estable cuando está atrapada en una solución de PBS, lo que indica que no hay cambios conformacionales significativos. Al exponerse a la solución ferrosa, las fluctuaciones en las desviaciones estándar de la traza aumentaron, lo que indica cambios estructurales dinámicos asociados con la carga de hierro. Después de 20 minutos de exposición al hierro, el rastro de transmisión se estabilizó, lo que indica la transición de la apoferritina a su holoforma.
Los gráficos de la función de densidad de probabilidad demostraron un cambio en la distribución de voltaje durante la carga de hierro, lo que respalda aún más la transición conformacional de apoferritina a holoferritina.
