Investigamos la microbiota que vive en los jardines de hongos de las hormigas cultivadoras. Queremos saber quiénes son y cómo están organizando este ecosistema microbiano. En particular, queremos saber cómo interactúa físicamente la microbiota con el hongo que cultivan las hormigas.
Y estas interacciones están mediadas principalmente por biopelículas. Los jardines microbianos cultivados por las hormigas es una muestra compleja y heterogénea compuesta por el hongo cultivado, el sustrato añadido para el cultivo y la microbiota. Además de ser muy delicado, es difícil encontrar métodos que conserven todos los componentes del jardín para la obtención de imágenes.
Nuestros hallazgos sugieren que la microbiota integra las estructuras del jardín de hongos, lo que también apoya que pueden participar en las respuestas fisiológicas de este entorno. Y también proporcionamos el conjunto de evidencias de que las biopelículas son importantes para estas interacciones. Nuestro protocolo preserva las estructuras de los hongos en las biopelículas al tiempo que simplifica otros procesos.
Sin embargo, conserva la delicada estructura del jardín, detallando aún más la interacción física de la microbiota y desvelando la estructura espacial de la biopelícula. Los biofilms son sistemas celulares en los que los microorganismos incrustados en una matriz de EPS forman redes sociales. La electromicroscopía de barrido nos permite observar con un detalle sin precedentes cómo se organiza espacialmente la microbiota en el jardín de hongos, alrededor de las hifas y en todo el sustrato.
Creemos que los pasos de preparación que sugerimos aquí se aplicarán ampliamente para refinar los estudios en otros ecosistemas microbianos. Para empezar, localice y marque la colonia de especies de hormigas attine. Excava una zanja alrededor del área del nido hasta que la cámara del jardín quede expuesta.
Abra la cámara de jardín lateralmente para evitar que la tierra se derrumbe sobre la superficie del jardín. Con pinzas entomológicas, recoja cuidadosamente muestras de jardín. Transfiera las muestras de jardín a un recipiente de plástico limpio que contenga una capa de yeso para equilibrar la humedad.
Después de transferir el jardín y las hormigas, cierre herméticamente el recipiente para evitar que la muestra se seque. Cierre la zanja con la tierra previamente removida. Guarde las muestras de jardín a una temperatura de 23 a 25 grados centígrados, hasta su posterior procesamiento.
Para la fijación de la muestra, use pinzas entomológicas para eliminar las obreras, los huevos, las pupas y las larvas de las muestras del jardín. Aparta los fragmentos de jardín que no superen los cinco milímetros cúbicos y añádelos a un tubo de dos mililitros. A continuación, con una pipeta de vidrio pasteur, añada aproximadamente un mililitro de solución fijadora de Karnofsky a los tubos para sumergir completamente las muestras.
Agite el tubo suavemente para dejar las muestras en remojo e incube las muestras a cuatro grados centígrados durante al menos 24 horas. Para empezar, obtenga fragmentos de colonias de especies de hormigas atinada en la solución fijadora de Karnofsky. Después de la fijación, retire completamente la solución fijadora de Karnofsky con una pipeta de vidrio sin alterar la muestra.
Incubar la muestra en serie con un mililitro de concentraciones crecientes de etanol, asegurándose de que la muestra permanezca inalterada. Después de eliminar el etanol por completo, con pinzas y espátula, transfiera cuidadosamente la muestra a un recipiente de muestras para el secador de puntos críticos. Coloque la tapa en el recipiente y sumérjalo en un vaso de precipitados de vidrio graduado que contenga suficiente etanol al 100% para sumergir el recipiente.
A continuación, transfiera el recipiente de la muestra a otro vaso de precipitados de vidrio graduado que contenga suficiente etanol al 100%. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, transfiera el recipiente a la secadora de puntos críticos.
Para empezar, obtener fragmentos de colonias de especies de hormigas atinadas sometidas a un secado en puntos críticos. Para preparar los portamuestras, envuelva los talones con un trozo de papel de aluminio, cubriendo solo la parte superior. Escriba el código o número de muestra en la parte inferior de cada talón para identificarlos, antes de cubrir la parte superior de los talones con cinta de carbón de doble cara.
A continuación, abra la tapa del recipiente de muestras y transfiera con cuidado la muestra seca a una placa de Petri de vidrio con pinzas y una espátula. Coloque con cuidado los fragmentos de la muestra de jardín en la superficie pegajosa del trozo cubierto con cinta adhesiva. Después de recubrir con oro por pulverización catódica, coloque los trozos en el portamuestras para microscopía electrónica de barrido.
Utilice las opciones en pantalla o el control manual para ajustar la ampliación y la posición de la imagen. Mueva la platina para obtener una vista completa de la muestra. Emplee la función RDC para centrarse en áreas específicas.
Al observar una estructura interesante, ajuste la ampliación, el enfoque, el brillo, el contraste y la estigmatización en consecuencia. Para una estigmatización correcta, utilizando la interfaz de usuario manual, mueva el escenario en las direcciones X e Y. Ajuste la velocidad de trama para comprobar la resolución de la imagen.
Ajuste el aumento de acuerdo con la pieza que se está fotografiando. Para guardar la imagen, utilice la función de congelación y haga clic en el icono de la foto. Configure la ruta del archivo para guardar la imagen.
Finalmente, analice al menos tres fragmentos de jardín, capturando imágenes en todos los rangos de aumento mencionados. Se observaron hifas fúngicas en jardines de atine como estructuras intactas en forma de tubo que cubren la superficie del sustrato, lo que indica una preparación efectiva de la muestra. Las biopelículas dispersas consistían en células microbianas que formaban una capa delgada de una a tres células que cubría la superficie del sustrato.
