Análisis de las interacciones teloméricas proteína-ADN utilizando pinzas magnéticas de una sola molécula

Se han utilizado métodos de una sola molécula para estudiar la interacción telomérica proteína-ADN. Sin embargo, la preparación de construcciones de una sola molécula con los motivos repetitivos teloméricos sigue siendo una tarea difícil. En este protocolo, describimos los pasos para expresar y purificar la proteína TRF2, preparar el ADN telomérico, establecer ensayos mecánicos de una sola molécula y analizar los datos resultantes.

Las herramientas de una sola molécula son técnicas poderosas para explorar las interacciones teloméricas proteína-ADN. Se han utilizado métodos mecánicos de una sola molécula, como pinzas magnéticas, pinzas ópticas y AFM, para investigar la distorsión del ADN dependiente de TRF2, revelar el apilamiento columnar mediado por TRF2 de la cromatina telomérica humana y observar la presencia de catálisis de telomerasa, entre otras aplicaciones. Investigamos las interacciones teloméricas ADN-proteína utilizando pinzas magnéticas de una sola molécula, lo que permitió mediciones precisas de los cambios en la extensión y la duración de las interacciones proteína-ADN bajo fuerzas aplicadas.

A partir de estas mediciones, derivamos la cinética de disociación de los complejos teloméricos ADN-proteína. Además, se reveló la formación de bucles dentro de estos complejos. Numerosas estructuras de proteínas de unión telomérica en complejo con el ADN se han resuelto mediante crio-EM, cristalografía de rayos X y RMN.

Estos conocimientos estructurales han avanzado en nuestra comprensión de las interacciones teloméricas proteína-ADN. Para investigar más a fondo la dinámica de estas interacciones, hemos desarrollado un método mecánico de una sola molécula específicamente para estudiar las interacciones teloméricas proteína-ADN. Las herramientas de una sola molécula son técnicas poderosas para investigar las interacciones proteína-ADN en los telómeros.

Estos métodos son especialmente valiosos para las conformaciones topológicas y el análisis de la cinética de la asociación y disociación proteína-ADN.