El objetivo principal de este procedimiento es implementar un protocolo integral para el cultivo y la caracterización de micrófagos en diferentes superficies de implante y la caracterización de los subtipos de micrófagos. Se emplean varios métodos como parte de esta caracterización, incluidos qRT-PCR, EISA y CLSM, para determinar los perfiles de expresión génica, las proteínas secretoras y los marcadores de superficie celular. Los resultados muestran la utilidad y efectividad del protocolo implementado para polarizar micrófagos y superficies de implantes, e identificarlos con precisión en función de la expresión génica, las proteínas secretadas y los marcadores de superficie celular.
Además, los marcadores describen patrones de expresión consistentes y específicos que se pueden utilizar para distinguir diferentes subtipos de MDM. En general, el estudio contribuirá al desarrollo y diseño de materiales inmunomoduladores para mejorar y promover procesos exitosos de regeneración de tejidos, prevenir la inflamación crónica asociada a los implantes y mejorar la integración exitosa del implante. Para comenzar, resuspenda las células mononucleares de sangre periférica humana aisladas en 15 mililitros de medio de fijación de monocitos precalentado y transfiéralas a un matraz de cultivo celular T-75.
Incubar las células a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 90 minutos para su adhesión. Después de la incubación, deseche el sobrenadante y lave las células una vez con un medio RPMI 1640 precalentado, suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina y estreptomicina inclinando suavemente el matraz para eliminar las células no adherentes o poco adheridas. Añadir 15 mililitros de medio completo que contenga 10 nanogramos por mililitro de factor estimulante de colonias de macrófagos a las células adherentes.
E incubar durante seis días para promover la diferenciación. Después de la diferenciación, retire el medio de cultivo del matraz y lave las células con 10 mililitros de PBS durante cinco minutos. Para separar las células de adherencia, agregue 10 mililitros de solución de desprendimiento de células precalentada e incube durante 30 minutos.
A continuación, golpee suavemente el matraz para liberar las células y transferirlas a un tubo de 50 mililitros. Para separar las celdas restantes, agregue 10 mililitros de PBS en el matraz y deseche las celdas. Transfiera las celdas separadas al tubo de 50 mililitros.
Centrifugar la suspensión celular desprendida a 300 g durante 10 minutos y desechar el sobrenadante antes de volver a suspender las células en cinco mililitros de medio completo precalentado. Con la tinción con azul de tripán, cuente las células en un hemocitómetro para determinar el número de células y la viabilidad. Prepare la suspensión celular ajustando el número de celdas a 160, 000 celdas por un mililitro de medio completo.
A continuación, limpie los discos de biomaterial por ultrasonidos en etanol al 70% durante cinco minutos, seguido de la esterilización en etanol al 70% durante 30 minutos. Después de secar los discos de titanio, colóquelos en una placa de 24 pocillos sin tratar y agregue un mililitro de suspensión celular preparada a cada pocillo. Incubar las células durante 48 horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono para obtener macrófagos M0.
Para obtener macrófagos polarizados M1, agregue interferón gamma y lipopolisacárido en los pocillos de una placa de 24 pocillos. Para la polarización M2, agregue interleucina-4 e interleucina-13. Incubar las células durante 48 horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono para inducir la polarización.
Después de obtener macrófagos polarizados derivados de monocitos de células mononucleares de sangre periférica humana, recoja el sobrenadante celular en un tubo de 1,5 mililitros. Transfiera el disco de titanio a una nueva placa de 24 pocillos. Centrifugar el sobrenadante celular a 300 g durante cinco minutos y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo.
Mida las citocinas y quimiocinas a 450 nanómetros de acuerdo con las instrucciones específicas proporcionadas por el fabricante. Calcule la concentración de citocinas o quimiocinas secretadas utilizando la curva estándar. Mida la cantidad total de proteína con el kit de ensayo de proteínas de ácido bicinconínico.
Normalizar la concentración de proteínas secretadas a miligramos de proteína total. Lave los macrófagos polarizados dos veces en 800 microlitros de PBS. Incubar los discos en 400 microlitros de tampón de fijación durante 20 minutos a temperatura ambiente.
Después de retirar el tampón de fijación, lave los discos tres veces en 400 microlitros de PBS. Ahora, incube los discos con 400 microlitros de tampón de bloqueo durante 30 minutos para bloquear los sitios de unión inespecíficos. Deseche el tampón de bloqueo e incube los discos durante una hora con anticuerpos primarios diluidos en 400 microlitros de tampón de tinción.
Después de una hora, retire los anticuerpos primarios y lave los discos tres veces con 400 microlitros de tampón de lavado. Agregue flúor para los anticuerpos secundarios marcados diluidos en tampón de tinción e incube durante una hora a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de la incubación, lave las muestras tres veces en el tampón de lavado durante tres minutos cada una.
Añadir 10 milimolares de DRAQ5 en PBS e incubar durante 15 minutos en la oscuridad. A continuación, retire el sobrenadante y lave los discos una vez con PBS. Agregue una gota de medio de montaje y, después de cinco minutos, aplique los cubreobjetos y deje que las muestras se sequen durante una hora.
Después del secado, selle los bordes con esmalte de uñas transparente. Para obtener una visión general de las células, obtenga imágenes de las muestras en un microscopio de escaneo láser confocal con un aumento de 25X. Cambie el aumento a 63X para determinar la estructura y la localización de los marcadores de superficie.
Los macrófagos primarios derivados de monocitos se polarizaron con éxito en macrófagos M1 y M2 en superficies de titanio, con CCR7 expresado más fuertemente en los macrófagos M1 y CD209 en los macrófagos M2. El análisis qRT-PCR mostró una polarización exitosa de macrófagos primarios derivados de monocitos tanto en superficies de titanio como de cubreobjetos con alta expresión de CCR7 y TNF-alfa para M1 y CD209 y CCL13 para M2. Los altos niveles de citocina inflamatoria TNF-alfa y quimiocina CCL13 confirmaron la polarización de M1 y M2 a nivel de proteína.
