Esta técnica aumenta los niveles de glucosa en líquido cefalorraquídeo o LCR en ratones sin afectar su concentración de glucosa en sangre. Esto ayuda a investigar los efectos directos de los altos niveles de glucosa en LCR en la función cerebral del animal. Esta técnica puede establecer modelos animales para explorar el papel teológico de la glucosa más alta en el LCR en la disfunción cognitiva.
Dando lugar al descubrimiento de nuevas dianas moleculares para mejorar la función cognitiva. El método también ayudará a determinar si los niveles altos de glucosa en LCR son suficientes para mediar fenotipos de trastornos neurodegenerativos en ratones. Se debe prestar atención al ensamblaje y cebado adecuados de la configuración de la cánula y la inserción de la cánula en el cerebro en las coordenadas correctas.
Para comenzar la cirugía para la implantación de minibomba osmótica, coloque el ratón anestesiado en el marco estereotáxico. Coloque la cabeza del animal en la barra incisiva. Cubra la nariz con el cono de la nariz para mantener la anestesia y conecte el flujo de isofluorano al cono de la nariz a una velocidad de 1.5 a 2%Coloque una almohadilla térmica debajo del mouse para mantener la temperatura corporal.
Después de desinfectar el área quirúrgica y hacer una incisión, exponga la superficie del cráneo con una espátula y limpie la sangre, si la hay, con puntas de algodón. Use un cauterizador si sangra profusamente. Frote con una punta de algodón sumergida en peróxido de hidrógeno al 3% para exponer las suturas craneales.
Trabajando bajo un microscopio, tome nota de bregma y lambda para navegar por las coordenadas del cráneo. Establezca todas las coordenadas en cero en bregma. Usando un taladro eléctrico con cuidado y sin romper la duramadre, haga un agujero en las coordenadas 0,5 milímetros posterior a bregma y 1 milímetro lateral a la línea media hacia la derecha.
Inserte un hemostático y ábralo y ciérrelo suavemente para hacer un bolsillo para la mini bomba. Sosteniendo la bomba desde la punta del modulador de flujo, empuje a través de la piel incisa hacia el bolsillo creado. Aplique un poco de pegamento en la parte inferior de la cánula y fíjelo en el soporte de la cánula.
Asegúrese de que la cánula no esté obstruida y que la solución fluya correctamente. Luego baje la cánula lentamente a través del orificio perforado, dos milímetros ventral a la superficie del cráneo. Déjelo allí durante al menos cinco minutos para permitir que el pegamento se solidifique.
Con la ayuda de tijeras, recorte la parte superior de la cánula asegurándose de que no se desprenda de la superficie del cráneo. Cubra la cánula con una capa de cemento dental para un soporte adicional. Para la recolección de líquido cefalorraquídeo o LCR, coloque el ratón debidamente anestesiado en el marco estereotáxico.
Después de fijar la cabeza en el marco como se demostró anteriormente, gire las perillas para inclinar la cabeza de modo que la nariz mire hacia abajo. Después de desinfectar el área quirúrgica y hacer una incisión, retire el soporte del cuerpo del ratón y deje que el ratón descanse verticalmente para que el cuello esté completamente extendido dorsalmente. Usando pinzas romas curvas, divide suavemente los músculos posteriores del cuello desde la línea media para crear una pequeña ventana.
Luego use un aplicador de punta de algodón húmedo para desplazar suavemente los músculos del cuello desde la línea media hasta la periferia. Observe si la cisterna magna está expuesta como una ventana triangular con una membrana de duramadre transparente. Coloque el conjunto del micromanipulador en el marco estereotáxico junto al ratón mientras se asegura de que la punta capilar no toque ninguna superficie.
Rompa suavemente la punta capilar sin alterar la configuración. Gire las perillas correspondientes en el micromanipulador para alinearlo lentamente y mover la punta capilar hacia la cisterna magna. Se siente cierta resistencia una vez que la punta capilar toca la membrana de la cisterna magna.
Muy lentamente empuje la punta contra la membrana con la ayuda de las perillas teniendo cuidado de no dañar ningún vaso sanguíneo en la membrana. A medida que se perfora la membrana, el LCR fluye hacia el capilar de inmediato debido a la presión capilar negativa. Deje la configuración durante unos minutos hasta que aproximadamente 10 microlitros de LCR se acumulen en el capilar.
Retire con cuidado el capilar de la jeringa y conéctelo a un dispensador de bulbo de microtapa. Presione la bombilla para transferir el LCR a un tubo estéril de microcentrífuga. Coloque el soporte debajo del ratón y gire las perillas estereotáxicas para nivelar la cabeza.
Cierre la herida con suturas de nylon. Inyecte 300 microlitros de solución salina estéril por vía subcutánea antes de retirar el ratón del aparato. Dar cuidados postoperatorios a los animales hasta que sea el momento de retirar las suturas, alrededor de 7 a 10 días después de la cirugía.
El LCR recolectado 10 días después de la cirugía mostró un aumento de aproximadamente seis veces en el nivel de glucosa en ratones, infundidos con 50% de glucosa en comparación con los ratones infundidos con LCR. Sin embargo, los niveles de glucosa en sangre no fueron diferentes entre los grupos. Mientras baja la cánula en el cerebro, retraigala hacia atrás y verifique si el LCR sale del agujero.
También es vital identificar correctamente la cisterna magna y prevenir la contaminación del LCR con sangre. Esta técnica también se puede utilizar para administrar cualquier medicamento que no pueda cruzar la barrera hematoencefálica para probar su efecto sobre la función cerebral. Hay un número muy limitado de modelos animales de diabetes, y alteran la homeostasis de la glucosa en el entorno periférico.
Este modelo, sin embargo, ayuda a investigar los cambios específicos del cerebro en la regulación de la glucosa en la función neuronal.
