Este protocolo permitirá a los investigadores no solo optimizar su proceso de análisis, sino que también les permitirá extraer más información de su flujo de organoides, mejorando así la relevancia traslacional. La principal ventaja de este protocolo es que combina un flujo de trabajo optimizado con una línea de análisis automatizada y clínicamente relevante, lo que permite a los investigadores obtener una cantidad convincente de información de una sola pantalla de organoides. Esta técnica se puede utilizar para predecir la respuesta a la terapia clínica para pacientes con cáncer a partir de estos exámenes de detección de fármacos organoides ex vivo con resultados iniciales muy prometedores.
El objetivo es hacer que la plataforma de soluciones de software sea agnóstica para que los investigadores puedan usar un instrumento de imagen de células vivas que esté disponible para ellos. Comience por disociar enzimáticamente los organoides tumorales derivados del paciente, o PDTO, en la matriz extracelular, o ECM, cúpulas en la microplaca de seis pocillos. Para esto, primero aspire el medio y lave las cúpulas ECM una vez con PBS.
Luego, agregue dos mililitros de la enzima de disociación en el pozo. Pipetear el contenido hacia arriba y hacia abajo 10 veces usando una pipeta de un mililitro para disociar mecánicamente los organoides en las cúpulas antes de incubar la placa durante 10 minutos a 37 grados centígrados. Después de la incubación, pipetear el contenido hacia arriba y hacia abajo, y comprobar la disociación adecuada de los organoides a células individuales con un microscopio.
Recoja la suspensión celular en un tubo de 15 mililitros y aumente el volumen hasta 10 mililitros agregando ADF + centrífuga el tubo a 450 g durante cinco minutos a temperatura ambiente, y aspire el sobrenadante con una pipeta Pasteur y una bomba de succión. Resuspender el pellet en 100 a 200 microlitros del adenocarcinoma ductal pancreático completo, o PDAC, medio de cultivo de organoides dependiendo del tamaño del pellet antes de contar el número de células utilizando un método de elección. Para colocar las celdas individuales en domos ECM, diluya la cantidad adecuada de suspensión celular agregando la cantidad requerida de ECM descongelada.
Luego, pipetear hasta 10 gotas de 20 microlitros por pocillo en una placa de seis pocillos precalentada a 37 grados centígrados. Invierta el plato e incube durante 30 minutos a 37 grados centígrados. A continuación, cubra los pocillos con el medio completo suplementado con 10 micromolares Y-27632 e incube durante dos o tres días en una incubadora.
Para cosechar los organoides de dos a tres días de edad, primero aspire el medio y lave los organoides una vez con PBS. Luego, agregue de uno a dos mililitros de solución de recolección de organoides, preenfriada a cuatro grados centígrados, a un pocillo de la placa de seis pocillos dependiendo del número de domos ECM. Incubar el plato mantenido en hielo, en una plataforma de agitación durante 10 minutos.
Ahora disocie los domos ECM pipeteando el contenido en los pocillos hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de un mililitro. Una vez más, incubar los organoides durante 10 minutos en hielo antes de confirmar visualmente la disociación de las cúpulas ECM bajo un microscopio. Recoja los organoides en un tubo de 15 mililitros, pre-recubierto con 0.1% BSA en PBS, y enrasque el volumen a 10 mililitros agregando ADF + Centrifugar el tubo a 200 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.
A continuación, aspire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet dependiendo de su tamaño en hasta un mililitro de medio organoide PDAC completo hasta la concentración final deseada de organoides. Abra la aplicación de control del robot de pipeteo, seleccione Protocolos y haga clic en Importar antes de arrastrar y soltar el Archivo complementario 6 proporcionado en el campo designado. Seleccione el protocolo importado.
Y de acuerdo con el diseño que se muestra en el campo Configuración de la cubierta, coloque todos los objetos de laboratorio, incluidos los elementos de refrigeración y los artículos de plástico, en las cubiertas. Utilice la ranura izquierda para el depósito de 25 mililitros y el elemento de refrigeración. A continuación, haga clic en Ejecutar protocolo y proceda a la configuración.
Abra la pestaña Configuración de Labware, haga clic en Run Labware Position Check y siga las instrucciones para calibrar el robot de pipeteo al nuevo hardware. Llene el depósito de 25 mililitros, colocado encima del elemento refrigerante, con la solución de siembra de organoides enfriada, y haga clic en Iniciar ejecución para poner en acción el robot de pipeteo. A continuación, centrifugar la microplaca a una velocidad de 100 g durante un minuto a cuatro grados centígrados.
Para crear el protocolo de dispensación de medicamentos utilizando el software de control del dispensador digital de medicamentos, coloque el cursor sobre la placa 1 sobre el diseño de la placa. Seleccione Editar atributos de placa y complete el tipo de placa como 384 pocillos, el volumen adicional como 50 microlitros y el límite DMSO como 1% Agregar líquidos haciendo clic en el botón de adición junto a Fluidos, y haga doble clic en el fluido recién creado para nombrarlo. Luego, seleccione la clase como basada en DMSO o acuosa más Tween 20, y complete la concentración.
Para crear el diseño de la placa para la valoración de medicamentos, seleccione Pozos y haga clic en Titulación. Para el líquido, seleccione el medicamento de interés, junto con la concentración más alta deseada y la concentración más baja. Para las réplicas, seleccione un mínimo de dos y elija el patrón de valoración deseado.
Para crear el diseño de la placa para el control positivo, seleccione tres pocillos, haga clic en Establecer valor y complete la estaurosporina de dos micromolares de un stock de 10 milimolares en DMSO para inducir la muerte celular máxima. Para Cytotox Green, seleccione todos los pocillos utilizados, haga clic en Establecer valor e ingrese un valor de 60 nanomolares por pozo. Para el control negativo y la normalización DMSO, seleccione todos los pozos con cuatro pozos adicionales para el control del vehículo.
Ahora haga clic con el botón derecho y seleccione Normalización antes de asignar la clase de fluido normalizado como basada en DMSO. Luego, normalice al volumen de clase más alto para obtener una concentración de DMSO igual en cada pozo. A continuación, haga clic en la flecha debajo de Ejecutar en la esquina superior izquierda y seleccione Simular siempre, seguido de hacer clic en Simular para identificar cualquier error y obtener los volúmenes de cada medicamento a preparar.
Ahora desmarque Simular siempre debajo del botón Ejecutar antes de hacer clic en Ejecutar para iniciar el protocolo de dispensación de medicamentos y siga las instrucciones. Aplique la membrana de sellado a la microplaca para evitar la evaporación. Abra el software de control del generador de imágenes de celda activa y seleccione Nuevo editor de métodos antes de ir a Archivo para importar el archivo XML del método de ejemplo.
Alternativamente, siga las instrucciones del manuscrito para crear un nuevo archivo. Luego, haga clic en Inicio para iniciar el escaneo en T0.To combinar y comprimir los datos, crear una nueva carpeta principal para transferir todas las carpetas de experimentos individuales generadas para cada escaneo en cada punto de tiempo por el software de control de imágenes de células vivas, y nombrar las carpetas respectivas siguiendo las instrucciones dadas en el manuscrito. Prepare un mapa de placas XLSX en el software de control de dispensadores digitales de medicamentos haciendo clic derecho en el diseño del mapa de placas del protocolo de dispensación de medicamentos y copiando todos los pocillos para pegar los datos en un archivo XLSX.
Elimine los datos de Cytotox Green y estaurosporina, agregue una matriz para la línea celular e ingrese un control negativo y un control positivo. Abra la herramienta de compresión de datos. Haga clic en Buscar, seleccione la carpeta principal y haga clic en Comprimir para iniciar la compresión de datos de imagen.
Todos los archivos de imagen TIFF se comprimen en un solo HDF5 para cada pocillo en una nueva carpeta de conjuntos de datos dentro de la carpeta parental. Para analizar las imágenes, vaya a la plataforma de aplicaciones web de análisis de imágenes, inicie sesión y haga clic en Agregar nuevo proyecto en la pestaña Inicio. Introduzca el nombre del proyecto, pulse Continuar y seleccione Agregar nuevo experimento antes de cargar la carpeta de conjuntos de datos que contiene los archivos HDF5.
Después de cargar, vaya a la carpeta del proyecto y del experimento para hacer clic en Cargar mapa de placas para obtener funcionalidades adicionales. Luego, haga clic secuencialmente en Ejecutar análisis, seleccione Análisis multiorganoide, Parámetros predeterminados y finalmente Analizar para iniciar el análisis de imágenes. Haga clic en Descargar resultados para descargar las tablas de datos sin procesar, que contienen las mediciones para cada pozo y las imágenes o videos segmentados antes de confirmar la precisión del análisis para su posterior procesamiento de datos.
Para tener en cuenta las variaciones en la densidad y el tamaño de la siembra de organoides, se utilizaron métricas basadas en la tasa de crecimiento para reducir las variaciones entre las réplicas, como lo indican las barras de error reducidas. Las imágenes para el control negativo, el control positivo y la combinación de gemcitabina y paclitaxel tratada con PDTO mostraron que la terapia indujo predominantemente la detención del crecimiento con una cantidad limitada de muerte celular, correspondiente con la respuesta normalizada al fármaco, o NDR, valor justo por debajo de cero. Al utilizar dos líneas adicionales, PDAC_052 y PDAC_087, se observó una clara diferencia en la tasa de crecimiento entre las tres líneas, lo que respalda el uso de métricas de GR.
Las curvas dosis-respuesta NDR dieron lugar a un mayor rango dinámico y separación entre los tres pacientes diferentes, en comparación con las curvas GR. La determinación de NDR a lo largo del tiempo mostró que PDAC_052 y PDAC_060 tuvieron una respuesta citostática muy similar a una dosis baja de gemcitabina-paclitaxel, mientras que se pudo observar una clara respuesta citostática diferencial versus citotóxica para las dosis medias y altas correspondientes. Estas respuestas farmacológicas fueron consistentes con las respuestas clínicas observadas en los pacientes.
La dinámica clonal reveló que PDAC_087 tenía los subclones más resistentes después del tratamiento, lo que es consistente con la naturaleza agresiva de la enfermedad observada en el paciente, quien, curiosamente, también fue el menos sensible al control positivo de estaurosporina. El aspecto más importante del protocolo es mantener todas las soluciones que contienen ECM enfriadas durante la siembra porque la solidificación incorrecta de la ECM puede interferir con el análisis de imágenes aguas abajo. La automatización del trabajo de laboratorio húmedo, el análisis de imágenes y el procesamiento de datos posteriores pueden ser útiles para acelerar la investigación e identificar nuevas terapias combinadas más fácilmente.
