Este método permite registrar potenciales de acción intracelulares similares en MEA tradicionales, lo que permite una mejor descripción de la forma AP y una clasificación más sensible de los potenciales pro-arrítmicos. En comparación con las grabaciones típicas de potencial de campo, la forma de potencial real intracelular proporciona más información sobre la autorización precisa de los canales iónicos subyacentes. Cuando se aplica a cardiomiocitos derivados de pacientes clínicos a través de la tecnología de células madre, el método puede contribuir al diagnóstico causal y la personalización de C R P y, enfermedades cardíacas como arritmias Nuestra técnica, Karin Gebhardt demostrará el cultivo de cardiomiocitos.
Para comenzar a cubrir los campos de electrodos de los MEA previamente esterilizados, Dropwise con fibronectina utilizando una pipeta de 10 microlitros debajo de la campana de flujo laminar. Para reducir el choque osmótico, transfiera la solución de recubrimiento gota a gota durante 90 segundos en el tubo de 50 mililitros que contiene cardiomiocitos descongelados. Agregue suavemente ocho mililitros de medio de recubrimiento en el tubo y mezcle la suspensión celular con cuidado.
Con una pipeta de 10 mililitros, retire el sobrenadante, asegurándose de no desechar el pellet y ajustar el número de células a la concentración final. Antes del asiento de la celda, retire la solución de recubrimiento aplicada del área del electrodo MEA con una pipeta de 10 microlitros. Para evitar el secado de la semilla de recubrimiento, las células inmediatamente agregando cuatro microlitros de las células gota a gota en los campos de electrodos para ambos, seis pozos MEA y un pozo M E A.Ahora, permita que las células se adhieran a los pocillos durante una hora a 37 grados centígrados, y 5% dióxido de carbono.
Debajo de la campana de flujo laminar, agregue 200 microlitros y un mililitro de medio de recubrimiento estéril calentado a 37 grados centígrados para seis pozos MEA y MEA de un solo pozo, respectivamente. Para grabaciones MEA, coloque el sistema MEA en la parte superior del dispositivo con el soporte del chip MEA centrado sobre el orificio del objetivo. Luego permita que el láser se enfoque en los electrodos posicionando la configuración MEA, de modo que el objetivo esté directamente debajo del orificio del sistema MEA.
Para permitir que las células se recuperen de la perturbación mecánica, transfiera el chip MEA con las células cultivadas de la incubadora a la configuración MEA 15 minutos antes de la grabación. A continuación, limpie las almohadillas de contacto y los pines cuidadosamente, utilizando un hisopo de isopropanol para disminuir los niveles de ruido. Coloque el MEA cuidadosamente en la configuración MEA y coloque el chip MEA de seis pocillos con el número de serie visible en el lado derecho o un chip MEA de un solo pozo con el electrodo de referencia a la izquierda.
Ahora, configure la calefacción integrada del sistema MEA a 38 grados centígrados. Cierre la tapa del dispositivo, ya que el interruptor de seguridad integrado solo permite activar el láser si la tapa está cerrada sobre el chip MEA. Usando el programa de configuración de MEA, establezca el filtro del sistema MEA de paso alto y paso bajo en 0.1 hertz o menos y 3, 500 hertz respectivamente.
Utilice el software de rack MC o cualquier software alternativo para grabar. Ajuste el rango de entrada de acuerdo con el experimento. Asegurar que la señal no sature el amplificador y la frecuencia de muestreo.
Utilice la función de visualización a largo plazo del software para comprobar la grabación. Después de insertar el chip MEA en la configuración MEA y configurar el software, inicialice la mecánica láser utilizando el software FB ALP. Ahora, haga clic en el botón de inicialización.
Al final de la inicialización, el punto láser virtual estará en el pozo D para un MEA de seis pozos y en la parte inferior izquierda para un solo pozo MEA, respectivamente. Luego, usando la tecla de control con un clic del mouse, mueva el punto láser virtual al centro del electrodo D cinco y ajuste el enfoque manteniendo presionada la tecla de control y desplazándose con la rueda del mouse. Como alternativa, utilice la función de enfoque automático.
Presione el botón Set P uno, y el punto láser virtual se moverá automáticamente hacia el pozo F. El sistema ahora está alineado. Ajuste la potencia del láser y el tiempo de proceso de acuerdo con los requisitos experimentales. Para habilitar el láser, haga clic en el botón de apagado del láser que aparecerá como láser encendido, cambie al software de grabación.
Elija un nombre de archivo y haga clic en el botón rojo de grabación seguido del botón de reproducción en la parte superior de la ventana para registrar la medición. Antes de abrir las celdas con el láser registre una línea de base durante 60 segundos. Vuelva al software de inicialización y desactive los electrodos para que el láser los excluya en el mapa virtual en el lado derecho de la ventana del software.
Para iniciar el láser, haga clic con Alt y seleccione el electrodo central de este pozo. Esto inicia el láser para abrir las celdas en cada electrodo de este pozo automáticamente, repita para cada pozo para abrir todos los electrodos previamente activados de este pozo seleccionado. Disuelva la concentración milimolar de Nifedipino E-40 31 y Dofetilida en DMSO primero, y luego en medio completo a 10 veces la concentración deseada.
Nunca exceda una concentración final de DMSO de 0.1% en el pozo. Registre la actividad de línea base durante 60 segundos. Inicie la peración inducida por láser como se demostró anteriormente, lo que resulta en una transformación de los FPS en liAP.
Aplique todos los medicamentos como concentración única por pocillo. Retire 20 microlitros y 100 microlitros de medio por pozo de seis MEA de pozo y pozo único, respectivamente. Agregue 20 microlitros o 100 microlitros de la solución madre del medicamento que se medirá en el pozo.
Dependiendo del tipo de MEA, y pipetear cuidadosamente hacia arriba y hacia abajo dos o tres veces. Deje que los compuestos se laven durante 300 segundos. Durante este tiempo, la forma liAP puede transformarse en la forma FP.
Una vez más, indujo peración inducida por láser y registra posibles defectos inducidos por compuestos en el liAP durante 60 segundos adicionales. La adición de nifedipino redujo la fase de meseta de los liAP de una manera dependiente de la concentración y, por lo tanto, acortó todo el liAP. Este acortamiento fue comparable a los potenciales de campo de los cardiomiocitos de electrodos no manipulados.
E-40 31 inhibió la repolarización de los canales de potasio KV un punto 11 relevantes y condujo al comportamiento arrítmico de los cardiomiocitos a concentraciones aumentadas. Además, E-40 31 aumentó la duración de liAP de una manera dependiente de la concentración. Al final del liAP se observaron pequeñas desviaciones positivas de voltaje a 0.1 micromolar que se hicieron más prominentes con concentraciones más altas, lo que indica una nueva despolarización transitoria llamada EAD.
En la concentración más alta de 0.1 micromolar, estos EAD aumentaron con el tiempo en latidos ectópicos. Que son potenciales de acción prematuros. EAD y latidos ectópicos son indicadores clave de la actividad pro arrítmica.
Y al final, la actividad eléctrica resulta en latidos arrítmicos. Las relaciones de respuesta de concentración se correlacionaron con las grabaciones de FP y liAP. Además, en presencia de dofetilida, tanto FP como liAP mostraron duraciones de aproximadamente dos segundos dentro del mismo pozo, la forma de onda FP presentó deflexiones de repolarización regulares.
Mientras que en el liAP EAD's son detectables. Es importante ajustar el enfoque antes de cada melomen, ya que una imagen de microscopio desenfocada podría afectar la apertura de las células. Además, el potencial de acción se toma poco después de que la opterperación debe usarse para el análisis.
Esta técnica es más sensible en la detección de efectos arrítmicos previos en comparación con la MEA estándar, lo que permite con mayor precisión la detección de efectos compuestos adversos.
