El análisis de monitor quirúrgico intraoperatorio sigue siendo un gran desafío en las cirugías de resección tumoral porque requiere una herramienta de diagnóstico para confirmar la escisión compleja de tejido canceroso con precisión y rapidez. Entonces es posible evitar cirugías repetidas debido a un margen quirúrgico positivo. Nuestra microscopía fotoacústica ultravioleta abierta de alta velocidad puede proporcionar imágenes histológicas etiquetadas de muestras de tejido en 18 minutos con un área de imágenes de cuadrados de cinco por cinco milímetros, mostrando un gran potencial para el análisis del margen quirúrgico intraoperatorio.
Demostrando el procedimiento estará Xiufeng Li, un estudiante de doctorado de último año de mi laboratorio. Comience con la configuración de la iluminación óptica para el sistema microscópico mediante el uso de un láser de estado sólido bombeado por diodo Q-switch con una longitud de onda de 266 nanómetros como fuente de excitación. Instale dos lentes convexas para expandir el rayo láser y coloque un agujero de alfiler cerca del punto focal de la primera lente convexa para el filtrado espacial.
Use un espejo galvanómetro 1D para reflejar el rayo láser hacia arriba. Con la ayuda de la lente del objetivo, enfoca el rayo láser en una muestra. Fije la UT enfocada en forma de anillo con el área activa hacia arriba en un tanque de agua hecho en laboratorio con una ventana ópticamente transparente en la parte inferior cubierta por una delgada cubierta de cuarzo, luego conecte el tanque de agua a una etapa manual de dos ejes del microscopio para controlar la posición lateral de la UT. Cuando haya terminado, encienda el láser UV y ajuste la posición de la UT para permitir que el rayo láser pase a través del centro de la UT, luego apague el láser UV y llene el tanque de agua con agua desionizada para sumergir completamente la UT. Conecte la salida del UT a dos amplificadores para obtener una ganancia total de 56 decibelios y luego conecte la salida del segundo amplificador a una tarjeta de adquisición de datos, o DAQ, instalada en la computadora.
A continuación, conecte un soporte de muestra a una etapa manual del eje Z conectada a etapas xy-motorizadas seguidas de la colocación de cuatro piezas de cinta de doble cara que rodean el orificio vacío del soporte de muestra. Más tarde, proceda a alinear el sistema conectando cinta negra a un portaobjetos de vidrio y luego coloque el portaobjetos de vidrio para cubrir el orificio del soporte de muestra con la cinta negra hacia abajo. Después de presionar el portaobjetos de vidrio en el soporte de muestra, baje el soporte de muestra para sumergir el portaobjetos de vidrio en el agua.
Desconecte la UT en forma de anillo y los amplificadores, luego conecte la UT al pulser/receptor y la salida del pulser/receptor a un osciloscopio. Opere el pulser/receptor en el modo de eco de pulso con la amplitud de pulso de seis y la ganancia a 20 decibelios. Una vez que se establecen los parámetros, ajuste la posición z del soporte de la muestra, defina la posición del plano focal acústico donde las señales ultrasónicas son máximas.
Cambie el pulso/receptor al modo de transmisión antes de ajustar la ganancia a 60 decibelios, luego habilite la salida láser y ajuste la posición z de la lente del objetivo para maximizar las señales fotoacústicas o PA medidas por el osciloscopio. Para que la señal de PA generada sea simétrica y máxima, ajuste la posición lateral de la UT en forma de anillo, luego ajuste la posición z del soporte de muestra para maximizar las señales de PA. Repita los ajustes para la posición z de la lente del objetivo y el soporte de la muestra para optimizar la simetría y la amplitud de las señales de PA.
Cuando las señales de PA estén optimizadas, registre el retardo de tiempo o el tiempo que tardan las ondas de PA en llegar a la UT en el osciloscopio. Mueva el soporte de muestra para obtener imágenes de diferentes posiciones de la cinta negra. Ajuste la planitud de los soportes de muestra de tal manera que las señales de PA generadas desde cada posición de la cinta negra tengan el mismo retardo de tiempo que la medida anteriormente.
Una vez completada la alineación del sistema, apague el láser y conecte el UT a los dos amplificadores. Para preparar una rebanada de cerebro de ratón fijada en formalina e incrustada en parafina, fije el cerebro cosechado en formalina tamponada al 10% neutra. Después de 24 horas, procese el cerebro fijo por deshidratación con alcohol graduado, limpieza con xileno e incrustación con parafina.
Use un microtomo para obtener rebanadas de cinco micrómetros de grosor del cerebro incrustado. Coloque las rodajas de muestra en los portaobjetos de cuarzo para que se sequen en un horno a 60 grados centígrados durante una hora. Más tarde, desparafina las secciones del cerebro con un agente de limpieza para evitar señales de fondo altas de parafina.
Para preparar una rebanada fresca de cerebro de ratón, lave el cerebro de ratón cosechado con PBS y luego corte una rebanada de cinco milímetros de grosor de la muestra de cerebro a mano, seguida de lavar la rebanada de cerebro con PBS para eliminar la sangre en la sección transversal. Para la colocación de la muestra, prepare un tanque de muestra hecho en laboratorio con una membrana de polietileno transparente UV con un grosor de 10 micrómetros, luego agregue una gota de agua a la membrana y coloque la muestra biológica en el tanque de muestra para cubrir el agua. A continuación, coloque el tanque que contiene la muestra en el soporte de la muestra asegurándose de cubrir el orificio vacío del soporte de la muestra.
Configure el láser UV en el modo de disparo externo y utilice el programa de vista de laboratorio construido en laboratorio para establecer los parámetros de escaneo como se describe en el manuscrito. Comience el escaneo de prueba en una región pequeña estableciendo el número de pasos móviles de los motores de los ejes x e y, a continuación, ajuste la etapa manual del eje z para colocar la muestra en el plano focal para obtener las máximas señales de PA. Después de mover los motores de los ejes x e y al punto de partida deseado y establecer la región de escaneo estableciendo los valores xn e yn, inicie el programa de adquisición de imágenes.
Cuando se requieran las imágenes, apague el láser y retire el soporte de muestra. Almacene los tejidos biológicos frescos en formalina tamponada al 10% neutra. Utilice las señales pa recopiladas para reconstruir la imagen de proyección de amplitud máxima con la ayuda de un algoritmo de procesamiento de imágenes creado en laboratorio.
El análisis representativo muestra las imágenes UV-PAM y H&E de una rebanada de cerebro de ratón FFPE. En la imagen UV-PAM ampliada, los núcleos celulares individuales podrían resolverse. Los núcleos celulares correspondientes se encontraron en las imágenes teñidas estándar de H&E, mostrando la alta precisión del sistema actual para imágenes celulares.
Se aplicó un algoritmo de aprendizaje profundo para transferir la imagen UV-PAM en escala de grises a una imagen virtual teñida de H&E. Es importante ajustar la posición del transductor ultrasónico en forma de anillo para permitir que la luz UV pase a través de un centro durante la alineación del sistema. Esto asegura que se pueda obtener una señal fotoacústica detectable y optimizarla aún más cuando el láser está encendido.
Nuestro algoritmo de clasificación se puede incorporar aún más para clasificar las regiones tumorales y normales en las imágenes, sirviendo como una imagen de asistencia y una plataforma de diagnóstico para profesionales médicos.
