Con el seguimiento de partículas sensibles a la masa, podemos observar biomoléculas individuales que se difunden en las membranas lipídicas y cuantificar su dinámica en tiempo real, todo completamente libre de etiquetas. Dado que no se requieren etiquetas, no hay peligro de perturbar el comportamiento dinámico de las biomoléculas. Otra ventaja de este método es su sensibilidad a la masa, que nos permite determinar los estados oligoméricos unidos a la membrana.
Debido a su versatilidad, podemos aplicar este método a cualquier sistema asociado a la membrana. En particular, se puede utilizar para estudiar la formación de complejos de receptores inducidos por ligandos. Comience distribuyendo un número igual de portaobjetos de microscopio en soportes de PTFE.
Transfiera los soportes de PTFE a los vasos de precipitados. Agregue agua ultrapura y sonicarlos durante 15 minutos a temperatura ambiente. Use pinzas para transferir los soportes para limpiar los vasos de precipitados y agregue isopropanol ultrapuro.
Sonicar de nuevo durante 15 minutos, luego de nuevo reemplazar el isopropanol con agua ultrapura, y sonicar el vaso de precipitados que contiene los soportes durante 15 minutos. Retire los soportes de los vasos de precipitados y seque los portaobjetos del microscopio en el soporte bajo un flujo constante de gas nitrógeno o aire comprimido. Coloque el soporte seco que contiene los grandes portaobjetos del microscopio en el limpiador de plasma y enciéndalo.
Envuelva el cartón plano con papel de aluminio. Extienda los portaobjetos de microscopio limpiados de 24 milímetros por 24 milímetros sobre el papel de aluminio con suficiente distancia entre sí. A continuación, coloque tiras de cinta adhesiva de doble cara en los bordes superior e inferior de las diapositivas.
Elimine cada portaobjetos de microscopio con un bisturí de modo que se pueda quitar del papel de aluminio. Cada diapositiva debe tener rayas de cinta adhesiva de doble cara unidas a los bordes superior e inferior de la diapositiva. A continuación, conecte la diapositiva con las dos tiras de cinta adhesiva de doble cara a la diapositiva hidrofilizada.
Esto formará una ruta de flujo entre los portaobjetos de microscopio más pequeños y más grandes. Diluya las pequeñas vesículas unilamelares recién extruidas, o SUV, a una concentración final de 0,4 miligramos por mililitro en el tampón de reacción requerido. Opcionalmente, para promover la ruptura de la vesícula, agregue dos milimolares de cloruro de calcio a la suspensión de la vesícula.
Monte una cámara de flujo en el escenario del fotómetro de masas. Enjuague 25 microlitros de la suspensión de vesículas en la cámara de flujo e incube la cámara durante dos minutos, luego retire las vesículas no fusionadas mediante el lavado repetido de la cámara de flujo con 200 microlitros del tampón de reacción cada vez. Una vez que la membrana lipídica esté libre de vesículas sin fusionar, agregue 50 microlitros de la proteína de interés a la cámara de muestra.
A continuación, establezca las condiciones de imagen, como el tamaño del campo de visión, el tiempo de exposición, la velocidad de fotogramas y el tiempo de adquisición en el software de adquisición. Ajuste el enfoque automáticamente. Si es necesario, utilice el control lateral para mover el campo de visión a una posición con una membrana homogénea.
Cree una carpeta de proyecto y comience a grabar la película. Una vez completada la grabación, especifique un nombre de archivo en el cuadro de diálogo solicitado por el software de adquisición. La película se guardará automáticamente en la carpeta del proyecto como un archivo MP para su posterior análisis.
Para analizar los videos grabados, inicie la aplicación Jupyter notebook. En la lista de carpetas que aparece, desplácese hasta la ubicación donde se encuentra el análisis MSPT. El archivo ipy notebook se almacena y haga clic en el archivo.
En los blocs de notas de Jupyter, el código se organiza en celdas y se puede ejecutar paso a paso. Haga clic en el pequeño botón Reproducir junto a la celda o seleccione una celda y presione Mayús Entrar para ejecutar la celda. Comience importando todos los paquetes necesarios para el análisis.
Ejecute la siguiente celda para iniciar un mensaje de archivo. Elija una carpeta que contenga uno o varios archivos de video MP para analizar y presione Seleccionar carpeta. Una lista de los archivos elegidos se imprime debajo de la celda.
Para eliminar la dispersión estática dominante de la luz con el algoritmo de estimación de fondo en píxeles, elija la opción de mediana continua para el modo de parámetro y establezca una longitud adecuada para la ventana mediana deslizante. Opcionalmente, guarde las películas después de la eliminación en segundo plano configurando save_processed_movies True para usarlas para la detección de partículas y la vinculación de trayectoria. Asegúrese de establecer el paralelo True y GPU False para el procesamiento en la CPU o viceversa para el procesamiento en una GPU.
Las partículas y su respectiva posición se identifican y localizan a lo largo de la película. Ajuste la sensibilidad de la detección de partículas con un parámetro de umbral que se utiliza para resaltar los puntos candidatos mediante binarización de imágenes. Examine el efecto de la variación de los parámetros de umbral en la sensibilidad de detección puntual en un bloc de notas independiente denominado Visualización de película.
cuaderno ipy. Después de cargar la película en el visor de fotogramas, utilice el control deslizante de umbral para ajustar el umbral de detección de partículas y encontrar una configuración adecuada. De vuelta al otro bloc de notas, elija tres parámetros para vincular partículas en fotogramas consecutivos en trayectorias utilizando el paquete de Python trackpy.
Establezca el desplazamiento máximo de partículas de un fotograma a otro de acuerdo con la velocidad de difusión máxima esperada. Seleccione el número máximo de fotogramas que una partícula puede desaparecer y reaparecer, pero que aún se considere la misma partícula. Las trayectorias con muy pocos puntos pueden eliminarse utilizando el parámetro minimum_trajectory_length para una determinación más robusta de los coeficientes de difusión.
Corrija todos los parámetros de la celda ejecutándola. Ejecute la siguiente celda para analizar todos los videos seleccionados con los parámetros elegidos. Las barras de progreso para cada paso de procesamiento aparecerán debajo de la celda.
Esto puede llevar un tiempo, dependiendo de la duración del video, la configuración de los parámetros y el hardware. En el siguiente paso, el software determina los coeficientes de difusión para las trayectorias encontradas en la sección anterior, basándose tanto en la distribución de la distancia de salto como en el análisis del desplazamiento cuadrático medio. Comience especificando el frame_rate de la película y pixel_size.
Corríjalos ejecutando la celda, luego ejecute la siguiente celda y seleccione el directorio principal que contiene todos los archivos CSV generados por trackpy. Una lista de los archivos CSV encontrados se imprime debajo de la celda. En la siguiente celda, elija un nombre para el contenedor HDF5 donde se almacenan los resultados y ejecútelo.
Finalmente ejecutar la celda C.4 para realizar el análisis de difusión. En la celda C.5 introduzca el contraste a los parámetros de la línea de calibración de masa, lo que significa la pendiente y el desplazamiento determinados utilizando muestras de masa conocida y ejecútelo para convertir todos los contrastes de partículas en la masa molecular. Evalúe la densidad aparente de partículas en la membrana ejecutando la celda C.6, que devuelve el valor de densidad mediana en términos de partículas detectadas y trayectorias presentes durante cada fotograma como columnas adicionales en el marco de datos.
Para generar la gráfica final para la correlación de masa y coeficiente de difusión, ejecute la celda D.1 para cargar un mensaje de archivo y especifique el archivo HDF5 que contiene los resultados de MSPT, luego seleccione el conjunto de datos de un solo video para trazar en la celda D.2 o combine los datos de varios videos en un solo marco de datos ejecutando la celda D.3. En este ejemplo, dado que todos los vídeos son réplicas de muestras idénticas, se agrupa el conjunto de datos. Finalmente, trace la densidad del núcleo 2D ejecutando la celda D.4.
Si está satisfecho, especifique una ubicación para guardar la gráfica en un archivo PDF en la celda D.5 y ejecútela. Aquí se muestran imágenes representativas de la rugosidad superficial de un portaobjetos de cubierta de vidrio durante la formación de una bicapa lipídica soportada, con una bicapa lipídica soportada intacta, y de proteínas ejemplares reconstituidas en un SLB. Los cuatro ejemplos se muestran en el modo nativo, al que se puede acceder durante la medición en sí, y como imágenes ratiométricas procesadas después de la eliminación del fondo basado en la mediana.
Una calibración que traduce el contraste en masa molecular se puede lograr uniendo biomoléculas de masa conocida a un SLB a través de un complejo de biotina-estreptavidina-biotina. Como estrategia ejemplar, se pueden utilizar variantes biotiniladas de albúmina sérica bovina, proteína A, fosfatasa alcalina y fibronectina que se unen a la estreptavidina que a su vez está unida a los lípidos que contienen biotina en la membrana. El contraste cada vez más pronunciado de estas macromoléculas ejemplares refleja el creciente peso molecular de los respectivos estándares biotinilados.
Al asignar cada pico de los histogramas de contraste a la masa correspondiente del estado del oligómero de la proteína estándar, se revela una relación lineal entre el contraste y la masa y posteriormente se puede utilizar para el análisis de sistemas de macromoléculas desconocidos. Aquí se muestran las estimaciones de densidad de kernel 2D tanto de la masa como del coeficiente de difusión de la estreptavidina tetravalente en complejo con aldolasa biotinilada o con un anticuerpo IgG anti-conejo de cabra modificado con biotina. Las imágenes representativas muestran una comparación de las masas de oligómeros determinadas para el complejo de estreptavidina tetravalente con aldolasa modificada con biotina o IgG y los pesos moleculares esperados.
Con MSPT, podemos rastrear biomoléculas directamente en las membranas lipídicas, determinar qué masa tienen, cómo se mueven y cómo interactúan. Estoy seguro de que esta técnica transformará nuestra comprensión de los procesos biológicos en y con las membranas.
