Este protocolo detallado describe un método altamente eficiente y rentable de expresión bacteriana para el dominio catalítico recombinante MMP-3 en E.Coli, que se puede aplicar a otras dianas terapéuticas MMP. E.coli carece de un complejo sistema de plegamiento de proteínas y procesamiento post-traduccional. Este método utiliza la cepa celular R2DP para mejorar la expresión de proteínas eucariotas en E. coli.
La sobreproducción de MMP específicos conduce a varias enfermedades como el cáncer, las enfermedades cardiovasculares y neurodegenerativas. Los MMP solubles activos son necesarios para el desarrollo de terapias inhibidoras de MMP. Inocular una sola colonia aislada de pET His-tag pro MMP-3 transformante de dominio catalítico de una placa lb resistente al cloranfenicol de ampicilina en cinco mililitros de medios resistentes al cloranfenicol de ampicilina LB a 37 grados Celsius.
Ahorre alícuotas de cada cultivo y prepare existencias de glicerol al 40%. Inocular un matraz de un litro que contenga 500 mililitros de lb de medio resistente al cloranfenicol de ampicilina LB a una densidad óptica de 0,05 a 0,1 a 600 nanómetros con el cultivo nocturno. Mida la densidad óptica a 600 nanómetros en varios puntos de tiempo, generalmente durante tres o cuatro horas hasta que caiga entre 0.4 y 0.6.
Inducir los cultivos con un stock molar de IPTG a una concentración final de un milimolar. Incubar en el agitador de 37 grados durante tres o cuatro horas adicionales. Centrifugar las células en frascos cónicos de 250 mililitros a 13.000 G y cuatro grados centígrados durante 10 minutos, repitiendo hasta que los cultivos estén completamente peletizados.
Agregue tres mililitros de tampón de lisis por gramo de pellet y resuspenda el pellet mediante vórtice o pipeteo. Añadir 1,25 mililitros de desoxicolato de sodio al 10% en peso por volumen por un litro de cultivo. Añadir 10 microlitros de DNasa I por un litro de cultivo.
Agitar a temperatura ambiente durante 30 minutos a 150 RPM. Centrifugar durante 10 minutos a 13.000 G y cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante.
Resuspend el pellet en 100 mililitros por litro de cultivo de tampón del cuerpo de inclusión mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo. Mantenga las muestras en hielo durante la sonicación para evitar el sobrecalentamiento. Sonicar cada muestra durante seis ciclos de 15 segundos, una salida de cinco y un pulso del 50%.
Centrifugar las muestras durante 10 minutos a 13.000 G y cuatro grados centígrados. Revisa el pellet. Si el pellet es compacto, deseche el sobrenadante.
Resuspenda cada pellet de un cultivo de un litro y cinco mililitros de tampón de solubilización. Incubar durante al menos 30 minutos en hielo para permitir que las proteínas se solubilicen. Centrifugar las células durante 10 minutos a 13.000 veces G en cuatro grados centígrados.
Si el pellet se forma después de la centrifugación, vierta el sobrenadante en un tubo cónico separado de 50 mililitros. Resuspend el pellet en otros cinco mililitros de tampón de solubilización por un litro de cultivo canalizando hacia arriba y hacia abajo. Centrifugar durante 10 minutos a 13.000 G y cuatro grados centígrados.
A continuación, tira de los sobrenadantes. Deseche el pellet o guárdelo a menos 80 grados celsius para una sonicación adicional. En blanco contra el tampón de lavado HT y registre el A280 de la primera fracción de lavado.
Repita con otras fracciones hasta que A280 se acerque a la línea de base. Eluya inmediatamente las proteínas marcadas con His agregando cinco mililitros de tampón de elución HT. Recoja el flujo a través de fracciones de 0,5 a un mililitro en tubos de microfugios etiquetados como elución HT.
Mida el A280 de la fracción de elución. Si el A280 es mayor de 0,3 miligramos por mililitro, diluya la fracción con tampón de equilibrio HT. Sumerja las fracciones de MMP eluidas en tubos de diálisis en un litro de tampón de diálisis uno y revuelva el tubo y su contenido en un agitador magnético durante al menos ocho horas a cuatro grados centígrados.
Transfiera a un litro de tampón de diálisis dos y revuelva el tubo y su contenido en un agitador magnético durante al menos ocho horas a cuatro grados centígrados. A continuación, transfiera a un litro de tampón de diálisis tres y revuelva el tubo y su contenido en un agitador magnético durante no menos de ocho horas a cuatro grados centígrados. Transfiera la muestra a un contenedor apropiado y etiquétela como MMP marcada.
Examine el tubo en busca de precipitado. Por una alícuota de mililitro de un miligramo por mililitro MMP, agregue 50 microlitros de APMA de 20 milimolares para alcanzar una concentración final de APMA de un milimolar. Si se forma un precipitado, centrímelo a velocidad máxima durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.
Guarde el sobrenadante en un tubo de microfuge de 1,5 mililitros etiquetado como MMP activado. Deseche el precipitado en un recipiente marcado para los residuos de APMA. SDS-PAGE se ejecutó para comparar las fracciones de elución de purificación his-tag del dominio catalítico His-tag pro MMP-3 de células BL21 DE3 en células R2DP.
Las primeras ocho fracciones de elución del dominio catalítico MMP marcado con His y las células BL21 DE3 mostraron menos proteína que las del dominio catalítico MMP marcado con His en células R2DP. Se muestran las fracciones inducidas, replegadas, concentradas, activadas y desaladas de las células MMP3 CD y R2DP. Tras la activación, el peso molecular de la banda de CD MMP-3 activada es de aproximadamente 20 kilodaltons, a diferencia del zymogen marcado con His, que permanece en alrededor de 30 kilodaltons.
Cuando se lisan las células centrífugas, los gránulos pueden no ser compactos. Cuando eso ocurra, sonicar más y centrifugar por más tiempo. Al reconcentrar la proteína, puede ocurrir precipitación.
Disolverlo en tampón de solubilización y repetir el proceso. El procedimiento descrito aquí proporciona un método detallado para la expresión soluble de MMP humanos activos que eventualmente se puede utilizar para comprender el mecanismo molecular de la actividad enzimática MMP. Se pueden realizar métodos alternativos de purificación de proteínas como FPLC a proteínas MMP purificadas.
