La lesión por herida de arma blanca es un método de lesión mecánica que induce la ablación celular inespecífica. Este método facilita la evaluación de la proliferación y diferenciación de RGC después de una lesión cerebral. La lesión por arma blanca mediada por aguja es un método simple e implementado de manera eficiente para inducir una lesión cerebral.
Este método se puede aplicar a muchas muestras experimentales utilizando un conjunto estándar de herramientas. La capacidad regenerativa del pez cebra se ilustró utilizando el modelo de lesión por puñalada. Los nuevos conocimientos sobre el mecanismo molecular que regula la regeneración neuronal contribuyen a la terapia regenerativa en el sistema nervioso central.
Comience colocando un pez cebra adulto anestesiado o medaka en una bandeja de espuma de poliestireno. Fije el pez en posición vertical entre dos agujas de calibre 30 insertadas verticalmente en la espuma de poliestireno. Sostenga el cuerpo del pez para evitar que la cabeza del pez se mueva, y luego inserte verticalmente una aguja de calibre 30 a través del cráneo en la región medial de una de las esferas del tectum óptico.
A continuación, transfiera los peces heridos a una pecera con agua fresca de la instalación. Una vez que los peces se hayan recuperado completamente de la anestesia, mueva el tanque al sistema de reproducción. Coloque toallas de papel en la bandeja de espuma de poliestireno para colocar el pescado anestesiado.
Luego mantenga el cuerpo del pez en su lugar insertando verticalmente dos agujas de calibre 30 a cada lado de la aleta anal. Una vez que se coloca el pez, haga una incisión ventral desde el ano hasta el corazón. Mantenga el corazón visible insertando dos agujas de calibre 30 en cada lado.
Luego use la punta de los fórceps para eliminar la capa epitelial plateada. Inserte la aguja de calibre 30 en el ventrículo, manteniendo el bisel hacia arriba, y haga una incisión en la aurícula con los fórceps. Luego, empuje PBS hacia la aurícula presionando la jeringa para eliminar la sangre de la aurícula.
Cuando se drene la sangre y las branquias se vuelvan blancas, detenga la perfusión de PBS. Más tarde, retire las agujas que fijan el cuerpo del pez en su lugar y fije el lado ventral del pez hacia abajo. Después de cortar la médula espinal y extraer el cráneo del tectum óptico y el telencéfalo, cortar los nervios ópticos y diseccionar el cerebro.
A continuación, transfiera los cerebros en tubos de 1.5 mililitros con un mililitro de paraformaldehído al 4% en PBS, para fijarlo durante la noche a cuatro grados centígrados. Después de lavar los cerebros fijos tres veces en PBS durante cinco minutos cada una, transfiera los cerebros en tubos de 1.5 mililitros con un mililitro de 30% de peso por volumen de sacarosa en PBS como crioprotector, e incubarlos durante la noche a cuatro grados centígrados. Prepare el compuesto de incrustación combinando 30% de sacarosa con 30 mililitros de temperatura de corte óptima, o OCT, compuesto, y almacene el compuesto a cuatro grados centígrados.
Para enfriar el criomold una vez, incube un bloque de aluminio durante la noche a menos 80 grados centígrados y coloque el bloque preenfriado en una caja de espuma de poliestireno con una tapa para evitar el calentamiento. Para las secciones coronales, incruste el cerebro disecado en un criomold ajustando la orientación usando fórceps bajo el microscopio. A continuación, coloque el criomold en el bloque de aluminio preenfriado en la caja de espuma de poliestireno y permita que el compuesto OCT se congele y se vuelva blanco.
A medida que el compuesto se congela, aplique un pequeño círculo de OCT compuesto en un disco de muestra antes de montar el criobloque en el disco de muestra. Al colocar el disco de la muestra en el criostato, congele el compuesto OCT. Luego coloque el disco de la muestra en la cabeza de la muestra en el criostato.
Después de establecer la orientación del criobloque, recorte la OCT para eliminar cualquier región adicional. Corte secciones seriadas de 14 micrómetros de espesor a través de todo el tectum óptico usando un criostato, y almacene las diapositivas a menos 25 grados centígrados. Se evaluó la proliferación de células gliales radiales, o RGC, en el tejido cerebral del pez cebra.
La mayoría de las CGR proliferaban con antígeno celular negativo en el hemisferio contralateral no lesionado. A los dos días después de la lesión, se indujo la proliferación de RGC en el lado lesionado del medaka tectum. Después de la lesión cerebral, el linaje celular y la diferenciación de RGC se evaluaron con el etiquetado de bromodeoxiuridina o BrdU.
El análisis representativo muestra neuronas recién nacidas a los siete días después de la lesión en el pez cebra lesionado y medaka. Uno de los pasos críticos en las lesiones por heridas de arma blanca es la inserción manual de agujas. Una lesión consistente es necesaria para crear resultados reproducibles.
Los tintes fluorescentes son efectivos como marcadores de heridas. El grado de difusión del tinte fluorescente indica la ubicación y la profundidad de la lesión de la herida de la puñalada. Esta técnica está potencialmente adaptada a otras especies de peces pequeños, y la adaptación a medaka permite comparaciones de la capacidad regenerativa.
