El uso de AAA-ATPasas para eliminar proteínas de una bicapa lipídica es un tema común en el control de calidad de proteínas. Una comprensión mecanicista de este proceso esencial requiere un sistema reconstituido. La reconstitución previa con AAA-ATPasas fue compleja y heterogénea.
Nuestro sistema es simple y está completamente definido. Esto nos permite manipular la AAA-ATPasa Msp1, el sustrato y el entorno lipídico. Para comenzar, agregue el tampón de reconstitución previamente preparado, las proteínas Msp1 y TA purificadas y los liposomas en un tubo de PCR, luego incube la mezcla en hielo durante 10 minutos.
Durante la incubación, corte la punta de una punta de pipeta P200 a aproximadamente 1/8 de pulgada de diámetro. A continuación, vórtice el tubo que contiene BioBeads a fondo para obtener una mezcla uniforme. Luego, retire rápidamente la tapa y use la punta de pipeta P200 cortada para transferir un volumen apropiado de las perlas a un tubo de PCR vacío.
Una vez que se complete la incubación de 10 minutos para la reconstitución, usando una punta de pipeta sin cortar, retire todo el líquido de las BioBeads. Luego, transfiera 100 microlitros de la reconstitución al tubo con los BioBeads y deje que gire sobre una rueda durante 16 horas. Al día siguiente, haga girar el tubo en un PicoFuge para peletizar las perlas, luego transfiera el material reconstituido a un tubo de PCR limpio y mantenga el tubo en hielo.
Para eliminar las proteínas que no se reconstituyeron en los liposomas, equilibre las columnas de espín de glutatión con un tampón de extracción, que generalmente implica tres rondas de lavado con 400 microlitros de tampón, seguido de centrifugación para eliminar el tampón. A continuación, agregue cinco micromoles de cada chaperona al material reconstituido, seguido de 100 microlitros de tampón de extracción, lo que eleva el volumen a 200 microlitros. Agregue esta mezcla a las columnas de espín de glutatión equilibradas, luego tapone las columnas de espín y gírelas durante 30 minutos, permitiendo que las chaperonas se unan a la resina.
Después de la rotación, gire las columnas brevemente. Recolectar el flujo a través, que es el material pre-limpiado agotado de proteínas agregadas. Colóquelo sobre hielo y proceda directamente al ensayo de extracción.
Preparar tubos para el análisis SDS-PAGE. Agregue 45 microlitros de agua destilada doble al tubo de entrada, 40 microlitros de agua al tubo de flujo y 16.6 microlitros de búfer de carga 4X SDS-PAGE a cada tubo. Para el ensayo de extracción, prepare la reacción de extracción y eleve el volumen final a 200 microlitros con el tampón de extracción.
Luego, precaliente el ensayo de extracción en un bloque de calor de 30 grados Celsius durante dos minutos. Para iniciar el ensayo, agregue ATP a una concentración final de dos milimoles. Gire el tubo durante cinco segundos en un PicoFuge e incube a 30 grados centígrados durante 30 minutos.
Durante la incubación, tome una muestra de cinco microlitros de la reacción y agréguela al tubo de entrada. Además, equilibre una columna de espín de glutatión para cada muestra en el ensayo de extracción como se demostró anteriormente. Una vez que se complete la incubación de 30 minutos, agregue 200 microlitros de tampón de extracción al tubo, llevando el volumen total a 400 microlitros.
Luego, agregue esta reacción a la resina de glutatión equilibrada y deje que gire durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Después de la rotación, gire las columnas para recoger el flujo a través, luego tome una muestra de 10 microlitros para el tubo de flujo a través. Lave la resina dos veces con 400 microlitros de tampón de extracción, descartando el flujo después de cada lavado.
Después del tercer lavado, mantenga el flujo y tome una muestra de 50 microlitros para el tubo de lavado. A continuación, prepare cinco mililitros de tampón de elución agregando glutatión reducido a una concentración final de cinco milimoles en el tampón de extracción. Agregue 200 microlitros del tampón de elución a la columna de centrifugado e incube durante cinco minutos.
Luego, centrífuga la columna y recoge el flujo. Repita el paso de elución una vez más. Después de la segunda elución, tome una alícuota de 50 microlitros de la muestra de elución y agréguela al tubo elutorio.
Después de ejecutar un western blot, la eficiencia de extracción se puede determinar comparando la cantidad de sustrato en la fracción elu con la fracción de entrada. La señal en el flujo muestra cierta variabilidad, pero generalmente es similar a la fracción de entrada, y no hay señal en la fracción de lavado. Por lo general, hay una eficiencia de extracción de aproximadamente el 10% para el control positivo y una eficiencia de extracción de uno a 2% para el control negativo.
Cuando las condiciones de reconstitución no están optimizadas, los niveles de extracción son comparables entre las muestras positivas y negativas. Esta técnica permitió a nuestro laboratorio probar las propiedades biofísicas del reconocimiento del efecto del sustrato por Msp1.
