Este protocolo permite a los fibroblastos construir y organizar su propio entorno bajo condiciones mecánicas definidas. Estos resultados en tejidos anisotrópicos con rigidez y composiciones matriciales comparables al entorno natural de la célula. Este método permite comparar hasta 48 condiciones en paralelo.
Es flexible con respecto al tipo de célula utilizada y las condiciones de cultivo. Al utilizar solo unos pocos componentes bien definidos, es reproducible entre laboratorios. Mediante la aplicación de factores profibróticos o fármacos antifibróticos, este protocolo se puede utilizar para estudiar los procesos subyacentes y las terapias de las enfermedades fibróticas de cualquier tipo.
Demostrando el procedimiento estaremos Alisa Degrave, una estudiante de doctorado de nuestro laboratorio, y yo. Para empezar, descongele los fibroblastos cardíacos crioconservados en un baño de agua a 37 grados centígrados durante aproximadamente dos minutos hasta que el vial se deje con solo una pequeña cantidad de hielo. A continuación, transfiera la suspensión celular gota a gota utilizando una pipeta serológica de dos mililitros a un tubo de centrífuga estéril apropiado que contenga 10 mililitros de medio de crecimiento de fibroblastos.
Para una recuperación celular óptima, enjuague el crio-vial con un mililitro de MGF y transfiéralo al tubo de la centrífuga. Resuspenda suavemente las células y transfiéralas a un matraz de cultivo celular. Reponga la MGF cada dos días durante cinco días o hasta que las células hayan alcanzado el 80% de confluencia.
Después de aspirar el medio de las células cultivadas, lave las células con seis mililitros de PBS y aspire, luego agregue seis mililitros del reactivo de disociación celular a las células e incube hasta que el desprendimiento celular sea visible. Neutralice la actividad enzimática agregando de seis a 12 mililitros de MGF a las células desalojadas en el reactivo de asociación celular. Pipete suavemente hacia arriba y hacia abajo de cuatro a ocho veces usando una pipeta serológica de 10 mililitros para asegurar una suspensión de una sola célula y transfiera las células a un tubo de recolección fresco de 50 mililitros.
Verifique el rendimiento con la ayuda de un contador de celdas automatizado según las instrucciones del fabricante y peletice las celdas. Después de la centrifugación, aspire el sobrenadante, mueva el tubo para desalojar el gránulo y resuspenda las células en la MGF. A continuación, cuele la suspensión celular a través de un colador celular de malla de 40 micrómetros, luego use un contador celular automatizado, evalúe el número de células y la viabilidad mediante la exclusión de corriente eléctrica para garantizar números de células confiables antes de continuar con los tejidos conectivos diseñados o la preparación ECT.
Para prepararse para la TEC, ajuste la suspensión celular a los 8.9 millones de células por mililitro a 20 a 25 grados Celsius agregando MGF y mantenga las células en hielo. Transfiera todos los demás tubos que contienen los componentes individuales de la mezcla de hidrogel ECT al hielo y enfríe previamente un tubo de centrífuga vacío de 50 mililitros para preparar la mezcla. Comience a preparar la mezcla de hidrogel ECT agregando los componentes descritos en el texto al tubo de centrífuga de 50 mililitros preenfriado evitando la formación de burbujas de aire.
En primer lugar, pipetear el hidrogel de colágeno soluble en ácido tipo I en una pipeta serológica con una punta de orificio ancha. Ajuste el contenido de sal de la solución de colágeno agregando el DMEM mientras gira suavemente el tubo para una mezcla adecuada. Para neutralizar el pH, agregue hidróxido de sodio molar 0.2 mientras gira el tubo y confirme la neutralización observando el color rojo del indicador rojo fenol.
Luego agregue la suspensión de la celda hacia abajo mientras gira suavemente el tubo. Mezcle la suspensión subiendo y bajando suavemente solo una vez usando una pipeta serológica con una punta de orificio ancha para evitar la formación de burbujas y minimizar el esfuerzo de cizallamiento. Agite suavemente el tubo 10 veces para una mezcla completa.
Mantenga el tubo de la centrífuga que contiene la mezcla de hidrogel ECT en hielo durante todo el proceso de fundición. Humedezca una punta de pipeta de un mililitro en la mezcla de hidrogel ECT, luego distribuya 180 microlitros de mezcla de hidrogel de manera uniforme en cada molde de la placa de fundición de 48 pocillos evitando fuerzas de cizallamiento excesivas que puedan afectar la integridad del ensamblaje de la matriz de colágeno y asegurando que toda la placa termine en 15 a 20 minutos. Asegúrese de que se forme un bucle completo dentro del molde, ya que la distribución discontinua de la mezcla ECT evitará la formación completa de un anillo ECT.
Evite pipetear en el pozo interno y formar burbujas durante el pipeteo para garantizar una fundición uniforme de hidrogel ECT para la formación de tejido homogéneo y funcional. Coloque cuidadosamente la placa de fundición de 48 pocillos dentro de la incubadora de cultivo celular para reconstituir la mezcla de hidrogel ECT durante 15 a 30 minutos. Después de la incubación, parece gelatinoso y opaco.
Agregue 600 microlitros de 37 grados Celsius de MGF caliente por pozo a lo largo de la pared suavemente para evitar el desprendimiento de ECT desde el fondo. Reemplace el medio todos los días con 500 microlitros de MGF hasta el análisis. En los puntos de tiempo deseados, use un microscopio estereoscópico para grabar imágenes microscópicas de las vistas superior y lateral de la TEC.
Utilice un programa de procesamiento de imágenes para realizar un análisis de escaneo de línea. Establezca una escala y utilice la herramienta de línea recta para trazar y medir los diámetros ECT a un mínimo de seis posiciones por brazo en cada plano de imagen. Imagine la placa de fundición de 48 pocillos bajo un dispositivo de grabación con una cámara de escaneo de área integrada colocada a una distancia fija equipada con un sensor de imagen monocromo de alta resolución y una fuente de luz casi UV.
Realice la detección automatizada de las puntas de los polos que contienen tinte fluorescente para maximizar el contraste. Mida la distancia entre los polos de los registros diarios utilizando un análisis automatizado ejecutando las imágenes grabadas en un software para detectar píxeles brillantes de alto contraste en un fondo oscuro o un programa de procesamiento de imágenes. Retire el ECT de los postes de retención e inserte un gancho de transferencia y un bucle ECT.
Luego transfiera el ECT a dos ganchos sujetos al brazo estacionario y al brazo transductor de un riómetro mecánico dinámico extensional equipado con un baño de órgano templado de 37 grados Celsius lleno de PBS. Aplique tensión uniaxial a una velocidad lineal constante ajustando el riómetro a aproximadamente el 1% de la distancia inicial entre los ganchos por segundo. Se puede utilizar una velocidad de estiramiento constante de 0,03 milímetros por segundo con dimensiones ECT típicas.
Desgarra la fuerza del transductor e inicia el estiramiento. Mantenga el registro hasta el punto de ruptura de la TEC después de normalizar la fuerza medida por área de sección transversal y trace la curva de tensión-deformación determinando diferentes parámetros biomecánicos. Justo antes de que el tejido comience la microfracturación, el límite superior de la región elástica corresponde al punto de elasticidad y su tensión es una medida de la elasticidad del tejido.
La región plástica está entre el punto de rendimiento y el punto de falla. El punto de falla corresponde a una caída repentina en el estrés debido a la ruptura del tejido, definiendo la tensión final que es una medida de la extensibilidad del tejido. El tercer punto de medición corresponde a la fuerza máxima definida por la mayor tensión que el tejido puede soportar sin romperse durante el estiramiento.
La resistencia y tenacidad dadas por el área bajo la curva corresponde a la energía absorbida por el tejido hasta el punto de rendimiento y el punto de falla respectivamente. Para cada curva obtenida, la pendiente de la parte lineal de la región elástica corresponde al módulo de Young, también conocido como módulo elástico. Es una propiedad mecánica que mide la rigidez del tejido.
Utilizando este protocolo, la compactación y contracción de la TEC en condiciones de control y en presencia de FCS se produjo unas horas después de la fundición y aumentó notablemente hasta el quinto día. Cuando la TEC se trató con el inhibidor de la polimerización de actina Latrunculina A, la compactación de la TEC se redujo según lo indicado por el área de sección transversal significativamente mayor en comparación con el control. La contracción de los tejidos se evaluó durante los cinco días de cultivo.
En ausencia de Latrunculina A, la contracción aumentó gradualmente hasta el quinto día alcanzando alrededor del 40% de contracción. Sin embargo, la presencia de Latrunculin A afectó la contracción del tejido, lo que resultó en solo un 20% de contracción máxima. La inhibición de la polimerización de actina condujo a una reducción significativa de aproximadamente el 50% en la rigidez del tejido durante el control.
Estos resultados demuestran que la integridad citoesquelética de la actina es esencial para la compactación, contracción y rigidez de la TEC. Es importante seleccionar una solución de colágeno confiable y de alta calidad y asegurarse de que se utilice una suspensión unicelular con alta viabilidad para reconstituir los tejidos conectivos diseñados.
