La mejora de la fluorescencia inducida por proteínas de una sola molécula puede complementar las mediciones de FRET de una sola molécula cuando se estudian subpoblaciones y conformaciones estructurales de proteínas, especialmente en los casos en que distintas subpoblaciones estructurales informan sobre estructuras locales estables. La principal ventaja de esta técnica es que captura distintas subtenuciones estructurales específicas del sitio en función de la proximidad del sitio de etiquetado del colorante a las superficies de la proteína. La mejora de la fluorescencia inducida por proteínas de una sola molécula se puede aplicar a cualquier sistema biomolecular de interés para sondear subpoblaciones estructurales distintas, locales.
Comience preparando 25 alfa-sinucleína picomolares marcadas con Sulfo-Cy3 en tampón de medición en un tubo de unión a proteínas bajas. Agregue 100 microlitros de un miligramo por mililitro BSA a la diapositiva de la cubierta de microscopía de 18 cámaras e incube durante un minuto, luego, deseche el BSA. Agregue 100 microlitros de 25 muestras picomolares de alfa-sinucleína etiquetadas con Sulfo-Cy3 en la cámara de la diapositiva de deslizamiento de la cubierta.
A continuación, para la adquisición de datos, agregue una gota de agua ultrapura en la parte superior de la lente del objetivo de inmersión en agua de alta apertura numérica, fije la diapositiva deslizante de la cubierta en la cámara del escenario y luego instale el conjunto en la parte superior de la etapa del microscopio. Lleve la lente del objetivo hacia arriba hasta que la gota de agua en la parte superior de la lente del objetivo se manche en la parte inferior de la diapositiva deslizante de la cubierta y abra el obturador láser. Cuando la lente del objetivo se mueva hacia arriba, inspeccione el patrón de los anillos aireados en una cámara CCD.
El primer anillo representa el foco en la interfaz agua/vidrio, y el segundo anillo representa el foco en la interfaz entre el vidrio y la solución de muestra. Aumente la altura de la lente del objetivo en 75 micrómetros para llevar el enfoque láser profundamente en la solución para minimizar la autofluorescencia de la superficie de vidrio del deslizamiento de la cubierta. Ajuste la potencia del láser en la lente del objetivo aproximadamente 100, microvatios.
Iniciar la adquisición de los fotones detectados durante un tiempo predefinido. Abra Jupyter Notebooks y, a continuación, abra el bloc de notas de ejemplo. Cargue el archivo de datos FRETBursts y Photon-HDF5.
Utilice el histograma de los tiempos de interfotón para calcular las tasas de fondo por cada 30 segundos de adquisición de datos. Mueva una ventana de tiempo de un fotón a la vez durante 20 fotones consecutivos y recopile los datos de los fotones si la velocidad instantánea de los fotones F es al menos 11 veces mayor que la velocidad de fondo para ese período de la adquisición de datos. Calcule el tamaño de la ráfaga y la cantidad de fotones en una ráfaga, la duración de la ráfaga, la diferencia de tiempo entre los tiempos de detección del último y el primer fotón en una ráfaga, el brillo de la ráfaga, el mayor valor de la tasa de fotones instantáneos en una ráfaga y la separación de la ráfaga, el intervalo de tiempo entre ráfagas consecutivas.
Graficlo el histograma de los valores de brillo de ráfaga con el eje de eventos en una escala logarítmica. Defina el umbral de brillo de ráfaga como el valor mínimo de brillo de ráfaga a partir del cual el histograma muestra un patrón de descomposición y selecciona las ráfagas con valores de brillo mayores que el umbral de brillo de ráfaga. Para la medición de la vida útil de la fluorescencia media de la ráfaga, trace el histograma de nanotiempo de fotones para todos los fotones en las ráfagas seleccionadas con el eje de recuento de fotones en una escala logarítmica.
Defina el umbral de nanotiempo como el valor mínimo de nanotiempo a partir del cual el histograma de nanotiempos de fotones exhibe un patrón de descomposición. Seleccione solo aquellos fotones con nanotiempos mayores que el umbral de nanotiempo. Calcular el promedio algebraico de todos los nanotiempos de fotones seleccionados.
Reste el umbral de nanotiempo del promedio algebraico de nanotiempo de fotones. El valor obtenido es el nanotiempo medio de fotones de la explosión, directamente proporcional a la vida media de fluorescencia. Traza el histograma de todas las vidas de fluorescencia medias de ráfaga.
Pueden aparecer las subpoblaciones distribuidas centralmente de la vida útil de la fluorescencia. Las subpoblaciones con promedios de menor valor representan las especies moleculares con Sulfo-Cy3 que no estaban obstruidas estéricamente, mientras que las subpoblaciones con promedios de mayor valor representan las especies de moléculas con S-Cy3 que estaban más obstruidas estéricamente. Para la evaluación de la dinámica lenta entre ráfagas, trace el histograma de los tiempos de separación de ráfagas con un eje de tiempo de separación en una escala logarítmica.
Seleccione esta opción para guardar todos los pares de ráfagas consecutivas que están separadas por menos de un tiempo máximo de separación que define la subpoblación de la misma molécula. Trazar un histograma o un diagrama de dispersión de las vidas medias de fluorescencia de la primera y segunda ráfaga para todos los pares de ráfagas que se repitieron por debajo de un cierto umbral de tiempo de separación. Los histogramas de las vidas medias de fluorescencia de una sola molécula de alfa-sinucleína-56, marcada con S-Cy3, mostraron que la primera subpoblación tenía una vida útil de fluorescencia característica de 1,6 nanosegundos, y representaba estados conformacionales de alfa-sinucleína con pocas superficies de proteínas en las cercanías del residuo 56.
La segunda subpoblación tenía una vida útil de fluorescencia característica de 3,5 nanosegundos y representaba estados conformacionales de alfa-sinucleína con más superficies proteicas en las proximidades del residuo 56. Se sabe que los segmentos de componentes beta no amiloides de las moléculas de alfa-sinucleína adoptan una estructura helicoidal y de horquilla al unirse a las vesículas SDS, que se confirmó como una población de vida útil de una sola florescencia con una vida útil característica de aproximadamente tres nanosegundos, y ausencia de la subpoblación con la vida útil característica de 1,6 nanosegundos. El histograma de los tiempos de separación entre ráfagas consecutivas de una sola molécula informa moléculas recurrentes para los tiempos de separación más rápidos que 100 milisegundos, donde la primera y la segunda ráfaga surgen de la misma molécula.
El histograma medio de la vida útil de fluorescencia de todos los estallidos de moléculas individuales mostró subpoblaciones con una vida útil característica corta, así como con una vida útil característica larga, lo que indica que las moléculas individuales podrían sufrir transiciones entre diferentes valores promedio de vida más lentos que los tiempos de duración de la ráfaga. Dentro de los tiempos de separación de ráfagas de 100 milisegundos como máximo, hubo una fracción de moléculas que comenzó como una primera explosión en la subpoblación de corta vida, y se repitió como una segunda explosión dentro de la subpoblación de larga duración. Mientras que la fracción de moléculas que comenzó como un primer estallido en la subpoblación de larga vida, y se repitió como un segundo estallido dentro de la población de corta vida, indica las transiciones entre las dos subpoblaciones dentro de 10 a 100 milisegundos.
Lo más importante a recordar al analizar los resultados experimentales es separar adecuadamente las señales de fluorescencia de una sola molécula del fondo y analizar ráfagas con suficientes nanotiempos de fotones. El desarrollo de smPIFE allanó el camino para que los investigadores exploraran las interacciones de proteínas de ácidos nucleicos a nivel de molécula única. Este avance establece las bases para estudiar la dinámica estructural local dentro de las proteínas.
