El protocolo describe cómo realizar inyecciones virales e implantar una ventana craneal para obtener imágenes de células cerebrales en ratones despiertos y con la cabeza restringida. La ventaja de este método es que la estructura y la actividad de las neuronas y los astrocitos se pueden obtener imágenes repetidamente durante múltiples sesiones. Este enfoque se puede utilizar para determinar cómo se alteran las células neuronales en modelos de neurodesarrollo o trastornos neurodegenerativos, o si la plasticidad dependiente de la experiencia se ve afectada.
Comience asegurando un mouse anestesiado a un marco estereotáxico usando la abrazadera del hocico y las barras para los oídos. Usando herramientas quirúrgicas estériles, corte y retire la piel de las suturas frontales anteriores a la bregma a posteriores a la lambda. Usando una cuchilla quirúrgica estéril de acero al carbono tamaño 11, raspe suavemente todo el tejido conectivo del cráneo.
Con la ayuda de un taladro dental, perfore gradualmente el hueso del cráneo a lo largo del contorno de la abertura en círculos concéntricos para facilitar incluso el adelgazamiento del hueso. Después de cada pasada concéntrica, agregue una gota o dos de solución salina al área perforada y permita que la solución salina se asiente durante al menos 10 segundos antes de reanudar la perforación. Empuje suavemente el área central del hueso del cráneo con fórceps finos para verificar que el cráneo se adelgace y se mueva adecuadamente.
Asegúrese de que la vasculatura subyacente donde ocurrió la perforación esté intacta y que el hueso no esté agrietado. Inserte cuidadosamente una cuchilla puntiaguda en miniatura de 15 grados en el hueso adelgazado y corte y use la espuma de gel empapada en solución salina para detener cualquier sangrado que pueda ocurrir. Usando fórceps, levante y retire cuidadosamente el hueso, teniendo cuidado de no dañar la duramadre.
Para la inyección, llene una pipeta de vidrio biselada estéril con una punta de 20 micrómetros con la mezcla de virus. Luego baje la pipeta para tocar la superficie del cerebro y continúe bajando durante 200 a 300 micrómetros adicionales para inyecciones de capa 2/3. Usando un sistema de dispensación de microinyección intracelular, inyecte presión el sistema de 12 a 15 veces durante dos minutos.
Para la implantación de la ventana craneal, coloque el vidrio de la cubierta sobre la abertura en el cráneo. Use fórceps para asegurarse de que el vidrio esté enrasado sobre la abertura. Para sellar los bordes de la ventana de vidrio al cráneo, aplique gel adhesivo de cianoacrilato alrededor del perímetro de la superficie de vidrio.
Sobre el gel adhesivo, aplique una capa de pegamento. Luego agregue una capa de líquido de cemento dental. Cuando el cemento dental se endurezca, aplique una capa delgada de pegamento alrededor de la abertura central de la placa de la cabeza tipo helicóptero y coloque la placa de la cabeza tipo helicóptero del tamaño apropiado sobre el vidrio de la cubierta.
Deje que el pegamento se seque. Agregue polvo de cemento dental en un tubo de microfugio de 1.5 mililitros hasta la marca de 0.1 mililitros. Mezcle de siete a ocho gotas de adhesivo instantáneo de curado rápido en el polvo y extraiga la mezcla resultante en una jeringa de un mililitro con una aguja de calibre 19 que se ha cortado para crear una abertura más grande.
Inyecte la mezcla de polvo a través de los orificios laterales de la barra del helicóptero hasta que se filtre desde cada lado. Aplique la mezcla adhesiva de cemento dental al resto del cráneo expuesto para sujetar la placa de la cabeza al cráneo. Envuelva el ratón en un paño y asegúrelo a través de su placa de cabeza al brazo de fijación de la cabeza de la jaula doméstica transportada por aire, luego deje la jaula doméstica expuesta a la luz.
Después de un tiempo de habituación de 15 minutos, retire el ratón de la jaula doméstica. Usando el modo de campo amplio del microscopio, seleccione de dos a tres posiciones de vasculatura fácilmente identificable. Guarde las imágenes de los vasos sanguíneos y registre las coordenadas x e y que aparecen en el controlador del motor.
Imagen de las estructuras sinápticas de las neuronas, y la actividad de GCaMP6f en astrocitos. En el análisis representativo, se evaluó la calidad de la ventana craneal con imágenes repetidas de dendritas y astrocitos que expresan GCaMP6f durante días. En una buena ventana, las estructuras neuronales parecían nítidas con espinas dendríticas claramente visibles.
Dos nuevas espinas aparecieron en el segundo día de la imagen. Solo una columna vertebral persistió y fue visible en el quinto día. La actividad del calcio se estudió en astrocitos que expresan GCaMP6f en diferentes puntos temporales.
Un evento global que abarcó toda la célula fue presenciado durante un combate de locomoción. Los dos pasos críticos de este protocolo son que el hueso debe adelgazarse adecuadamente antes de la extracción del hueso y la colocación adecuada del vidrio de la cubierta sobre la abertura. Las imágenes se pueden combinar con el análisis del comportamiento, ya sea durante la obtención de imágenes o después del comportamiento, como el aprendizaje de una nueva habilidad motora, para determinar cómo la estructura y función neuronal y de los astrocitos se modula mediante el aprendizaje.
