La visualización de la absorción de pequeñas vesículas extracelulares, también conocidas como sEV, por diferentes células de la médula espinal, puede confirmar una entrega exitosa de sEV. Esto permite estudios mecanicistas y terapéuticos de sEV administrados intratecalmente de diversas fuentes en modelos de roden. Este protocolo se puede utilizar para visualizar la absorción de sEV por las células en una médula espinal leve, y puede ayudar a evaluar el papel de los sEV y sus moléculas de carga en los trastornos de la columna vertebral, el dolor y la inflamación.
Este procedimiento será demostrado por mí, junto con Xuan Luo a nd Zhucheng Lin, los dos estudiantes graduados en el laboratorio del Dr. Seena Ajit. Comience colocando deslizamientos de cubierta de 18 milímetros en la placa de 12 pozos, luego placa neuro-2a células en cada pozo con un total de 1 mililitro de DMEM completo que contiene 10% FBS y 1% de estreptococo de pluma. Cuando la fluidez del recuento celular haya alcanzado el 80 al 90%, cambie el medio a medio agotado de exosoma DMEM en cada pozo, agregue uno, 5 o 10 microgramos de sEV etiquetados.
Durante 1, 4 y 24 horas. Para la absorción dependiente de la dosis y el tiempo al resto de los pozos a un volumen igual de control del tinte. Recoge los cerebros de los cachorros postnatales en una placa de Petri de 60 milímetros que contiene una solución de sal equilibrada Hanks helada suplementada con 10 hepes milimolares, disecciona ambos lóbulos corticales y elimina las meninges.
Luego pica los tejidos con una cuchilla esterilizada. Transfiera los tejidos a un tubo cónico de 15 mililitros que contenga Pepane o desoxirribonucleo un tampón de disociación e incube durante 20 minutos a 37 grados centígrados, girando el tubo cada 5 minutos, aspire el sobrenadante y agregue 5 mililitros de DMEM completo al tubo. Para inactivar la actividad enzimática, trate de calificar cuidadosamente para disociar los tejidos con una pipeta serológica de vidrio de 5 mililitros y una pipeta de pasto pulida con llama.
Pase la suspensión celular a través de un colador celular de 40 micrómetros, y luego centrífuga las células a 250 veces G durante 5 minutos a 4 grados Celsius, aspire el medio y vea las células en 10 mililitros de DMEM completo en un matraz de 75 centímetros cuadrados. Después de 4 horas de chapado, reemplace el sobrenado y el medio con 15 mililitros de medio DMEM fresco. Después de 14 días in vitro para separar la microglía y los oligodendrocitos, transfiera el matraz a un agitador orbitario a 320 RPM durante 6 horas.
Use 5 mililitros de la enzima de disociación celular durante 10 minutos a 37 grados centígrados. Para tripsinizar, los astrocitos restantes, para inactivar la acción enzimática, agregue 5 mililitros de DMEM completo y luego peletice las células a 250 veces G durante 5 minutos a 4 grados centígrados. Resuspenda las celdas en DMEM completo y vea las celdas en los deslizamientos de la cubierta de 12 milímetros número 1.5 en una placa de 24 pozos.
Usando PBS enjuague las células 3 veces y luego corríjalas con formaldehído o PFA de 4% de potencia en PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente. Lave las células fijas 3 veces durante 5 minutos con PBS y permeabilícelas usando 0.1%Triton X 100 en PBS durante 10 a 15 minutos. Luego repita los lavados con PBS.
Use suero de cabra normal al 5% o NGS en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente para bloquear las células, incube las células neuro-2a con anticuerpos bidireccionales map y los astrocitos primarios con anticuerpos GFAP en una proporción de 1 a 500 en 5% NGS fresco o PBS durante la noche a 4 grados Celsius con agitación suave. Después de lavar las células 3 veces en PBS, agregue los anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforo en 5% NGS. Incubar durante 2 horas a temperatura ambiente protegido de la luz en un balancín.
Repita el lavado con PBS e incube la celda con 1 microgramo por mililitro de DAPI durante 10 minutos a temperatura ambiente. Una vez más, lave las células 3 veces con PBS. Usando un medio de montaje antidesvanección, monte los resbalones de la cubierta en las diapositivas número 1, déjelas secar durante la noche en la oscuridad y guarde las diapositivas de vidrio preparadas a 4 grados Celsius hasta obtener imágenes en un microscopio confocal.
Diseccionar la médula espinal y fijarla en 4% PFA en PBS a 4 grados Celsius durante 24 horas. Proteja previamente los tejidos en sacarosa al 30% en PBS a 4 grados Celsius durante 24 horas o hasta que los tejidos se hundan y luego almacene los tejidos a 4 grados Celsius hasta inmunohistoquímica, inmbró la médula espinal L4 L5 en el compuesto OCT, luego congeló en hielo seco hasta que esté completamente solidificada. Use un criostato para seccionar los tejidos a 30 micrómetros y recolectar las secciones en una placa de 24 pozos que contenga PBS.
Lave las secciones 3 veces durante 5 minutos cada una con 0.3% Tritón en PBS, Bloquee los sitios de unión no específicos usando 5% MGS en 0.3% Tritón PBS durante 2 horas a temperatura ambiente. Incubar las secciones durante la noche a 4 grados centígrados en una coctelera. Lavar las secciones 3 veces durante 5 minutos con 0.3% Tritón en Pbs.
Luego agregue la concentración adecuada de los anticuerpos secundarios. Según el manuscrito del texto, incube a temperatura ambiente durante dos horas, lave las secciones usando solo PBS e incube en 1 microgramo por mililitro de DAPI durante 10 minutos a temperatura ambiente. Luego repita los lavados de PBS bajo un microscopio de luz, monte las secciones en una diapositiva adhesiva transparente con un pincel fino.
Humedezca el resbalón de la cubierta con el medio de montaje y cure durante la noche en la oscuridad a temperatura ambiente, adquiera imágenes bajo un microscopio confocal con los láseres respectivos, El tamaño medio promedio de ra 2 6 4 0.7 sEV derivados fue de 140 nanómetros y el tamaño máximo de partícula fue de 121.8 nanómetros. Con las partículas más detectables que caen dentro del rango de tamaño de los exosomas o sEVS. A 50 a 150 nanómetros, el western blotting de sEV, Lisato celular y medios exodpleted, demostró que las muestras de proteínas derivadas de sEV contenían las proteínas marcadoras de sEV Alix CD81 y GAPDH.
El lisato celular se enriqueció con retículo endoplásmico, proteína residente Calnexin por lo que Calnexin sirvió como un marcador negativo para la contaminación celular ya que estaba ausente en los sEV. Se observó que la absorción de los sEV ocurrió a 1 hora y para los sEV de 1, 5 y 10 microgramos, la fluorescencia posterior a la incubación se pudo detectar a las 4 horas, para 4, 5 y 10 microgramos de sEV. Se examinó la captación de SEV etiquetados con PKH 26 por los astrocitos primarios y se observó la máxima fluorescencia de la captación de sEVS en los astrocitos corticales primarios a las 24 horas En que se tomaron los sEV etiquetados con PKH26 y se observó la máxima fluorescencia a las 6 horas, después de la inyección en las neuronas astrocitos y las células microgliales.
La inclusión de controles, sEV sin etiquetar y control de tinte crea código a un viento falso positivo señales recientes debido al etiquetado ahora específico de la danza Opry de las costas de parches de tinte unbound. La absorción de seVs se puede confirmar investigando la transferencia de carga biomolecular a la receta y las células y tejidos y determinando los cambios en los niveles de expresión de biomoléculas o genes diana. También se pueden realizar estudios de comportamiento para investigar el impacto funcional de la administración de sEV.
