Name: applications of immobilization of drosophila tissues with fibrin clots for live imaging
Uploaded: 2020-12-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging at JoVE.com

El trabajo en el laboratorio Januschke está respaldado por las subvenciones fiduciarios Wellcome 100031/Z/12/A y 1000032/Z/12/A. La instalación de imágenes tisulares está respaldada por la subvención WT101468 de Wellcome.

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G., Ashe, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+ovarian+germline+stem+cell+cytocensor+projections+dynamically+receive+and+attenuate+BMP+signaling.">Drosophila ovarian germline stem cell cytocensor projections dynamically receive and attenuate BMP signaling.</a> Developmental Cell. 50 (3), 296-312 (2019).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. 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ImageJ macros [software] Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/nicolasloyer?tab=repositories">https://github.com/nicolasloyer?tab=repositories</a> (2020)</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Las imágenes en vivo de cerebros larvarios enteros del monte D. melanogaster proporcionan la oportunidad de observar divisiones asimétricas de células madre neuronales en condiciones cercanas a un contexto fisiológico. La primera parte de nuestro protocolo introduce nuestro enfoque sobre la disección de cerebros larvarios. Como ya se ha dicho13,un aspecto crítico de la preparación es evitar dañar el cerebro. El aspecto más desafiante de esto es separar el cerebro de los discos imaginales vecinos sin tirar excesivamente sobre el cerebro. Nuestro enfoque para "cortar sin tirar" es realizar un movimiento de molienda con las puntas de un par de fórceps, o deslizar una punta de fórceps a lo largo de otras dos puntas de fórceps que sostienen la conexión entre los tejidos(Figura 1A),mientras que Lerit et al. describen los movimientos similares a las sierras con un pasador diseccionador. Aconsejamos al experimentador que pruebe todos los enfoques y adopte el más adecuado para sí mismos. También sugerimos el uso de puntas de pipeta recubiertas de BSA o FCS en lugar de herramientas de disección para transferir cerebros aislados. El revestimiento evita que los tejidos se peguen al plástico y permite la transferencia segura de los tejidos manteniendo siempre completamente sumergidos, sin someterlos a una posible deformación transitoria, ya que se adhieren a la herramienta de disección durante la transferencia. Las puntas recubiertas tienen otras ventajas para permitir la transferencia de varios cerebros a la vez, lo que es particularmente útil cuando es fundamental controlar el tiempo de residencia de las muestras dentro de un medio en particular; son adecuados para la transferencia de otros tejidos, incluso frágiles como, por ejemplo, cuerpos gordos; pueden acomodar una amplia gama de diferentes tamaños de muestra mediante el uso de puntas más grandes o el corte de la extremidad de la punta.
A continuación, este protocolo describe el uso de la coagulación de Fibrinogen para inmovilizar cerebros larvarios en la portada de un plato de cultivo. Un cerebro está orientado dentro de una gota de medio de cultivo + Fibrinógeno, después de lo cual la coagulación es inducida por la adición de trombina. La formación de fibrina es gradual, proporcionando una ventana de tiempo durante la cual la orientación de la muestra se puede ajustar, si es necesario (Figura 2C). Si se requiere una ligera compresión de la muestra - que aconsejamos en el caso de los cerebros larvarios - también se puede ajustar finamente presionando el coágulo más o menos cerca de la muestra durante los pasos 3.4.4 y 3.5.2. La principal ventaja de esta coagulación de Fibrinogen sobre el protocolo descrito en Lerit et al., en el que los cerebros se montan entre una membrana permeable al gas y un tubo de cubierta, es la capacidad de reemplazar el medio de cultivo durante las imágenes en vivo. Una posible ventaja de utilizar una membrana permeable al gas sobre nuestro protocolo podría ser que proporciona una oxigenación óptima de las muestras, que podría ser más limitada con nuestro enfoque a medida que los cerebros están separados del aire por el coágulo y algún medio. Por esta razón, aunque no evaluamos el efecto de la cantidad de medio de cultivo dentro del plato de cultivo, sugerimos limitar la cantidad de medio de cultivo encima de los coágulos manteniendo los coágulos completamente sumergidos.
Como la manipulación de los coágulos puede ser experimentalmente difícil y lenta, recomendamos que el experimentador primero practica manipular coágulos sin muestras. Modular el volumen de la gota de medio de cultivo + Fibrinógeno en el deslizamiento de cubierta, la concentración de Fibrinógeno o el volumen y concentración de trombina podría ayudar a facilitar la preparación y podría ser importante a la hora de adaptar el protocolo a otros tipos de tejidos. Con suficiente experiencia manipulando los coágulos, varios cerebros pueden ser inmovilizados en un coágulo si es necesario, aunque complica el ajuste de la orientación. Se pueden formar varios coágulos en el deslizamiento de cubierta, lo que permite, por ejemplo, tomar muestras de imágenes de diferentes genotipos. También es posible exponer diferentes coágulos en las mismas portadas a diferentes medios de cultivo, aunque hay que tener cuidado de no mezclar nunca las gotas de medio de cultivo que cubren los diferentes coágulos. Una vez que los cerebros larvarios están inmovilizados y listos para la toma de imágenes en vivo, aconsejamos seguir las recomendaciones de Lerit et al.13 para evitar el fotodamage excesivo. Sólo a estas recomendaciones nos sumamos no sólo para mantener los cerebros a 25 °C durante las imágenes en vivo con una incubadora de etapas, sino también para precalentar esta etapa durante al menos 30 minutos antes del inicio de la toma de imágenes. En nuestras manos, no hacerlo sistemáticamente resulta en una fuerte deriva de enfoque.
Puede ser ventajoso en algunos contextos poder realizar microscopía correlacionada y fijar e inmunodeprimar una muestra después de la toma de imágenes en vivo. Sin embargo, una limitación del uso de coágulos de Fibrin es que es casi imposible aislar mecánicamente un cerebro de un coágulo sin dañarlo. Una posible manera de superar esta limitación podría ser desarrollar métodos para degradar coágulos de Fibrina con Plasmin o para inducir el desmontaje del coágulo mediante la adición de un péptido imitando las perillas permitiendo la polimerización fibrina28. Normalmente usamos coágulos de fibrina en muestras que van desde células individuales hasta tejidos largos de 200 μM, pero también podríamos inmovilizarnos con éxito en coágulos y cerebros de imágenes de abejorros adultos de más de 3 mm de ancho. Queda por determinar el límite superior del tamaño de la muestra que se puede inmovilizar en coágulos. Del mismo modo, aunque normalmente tomamos muestras inmovilizadas de imagen durante 4 a 5 h, realizamos imágenes exitosas de neuroblastos en cultivo primario durante un período de hasta 3 días, lo que indica que el coágulo al menos no interfiere con la viabilidad a largo plazo. Por el contrario, los coágulos pueden facilitar la sustitución regular del medio, un requisito para la toma de imágenes a largo plazo, sin necesidad de dispositivos como bombas peristálticas para este fin. Si bien no hemos medido los parámetros de permeabilidad de los coágulos de fibrina, la naturaleza fibrosa similar al gel de los coágulos parece ser penetrable por moléculas permeables celulares. Encontramos que latrunculina A, Colcemid o 1-NAPP1, ligandos de etiqueta HALO y otros tintes estándar utilizados en la biología celular llegan a las células en el coágulo de fibrina sin ningún problema y hasta ahora no han encontrado moléculas que serían retenidas por el coágulo, que, sin embargo, es una posibilidad que necesita ser probada empíricamente.
En conclusión, el uso de coágulos de Fibrin proporciona una forma fiable y relativamente fácil de implementar una forma de inmovilizar los tejidos vivos para obtener imágenes en vivo. Más allá de su utilidad para limitar la deriva lateral, la capacidad de cambiar el medio de cultivo durante las imágenes en vivo ha demostrado ser invaluable para nuestro enfoque de genética química para estudiar la división celular asimétrica de los neuroblastos D. melanogaster 21. Anticipamos que esta técnica será beneficiosa para los estudios en una amplia gama de tejidos diferentes, particularmente si implican genética química o, por ejemplo, autoetiquetamiento de proteínas29.
Nuestra macro MultiHyperStackReg se basa en el plugin TurboReg ImageJ, que alinea fotogramas o sectores sucesivos de una pila, y el plugin MultiStackReg ImageJ, que permite aplicar las transformaciones a otras pilas. MultiHyperStackReg simplemente permite aplicar estas transformaciones a hiperstacks (pilas con al menos cuatro dimensiones). Como el uso de MultiHyperStackReg, como lo describimos, requiere muchas acciones y puede llevar bastante tiempo, también escribimos la macro AutoHyperStackReg, que realiza automáticamente todos los pasos descritos en los pasos 6.2 y 6.3. Sin embargo, contrariamente a MultiHyperStackReg, AutoHyperStackReg actualmente carece de la posibilidad de calcular la alineación de una pila basada en una subregión de esta pila, una opción que encontramos a veces es crucial para una alineación satisfactoria. Otra limitación de AutoHyperStackReg es que su uso está restringido a traducciones y no a las otras transformaciones propuestas por TurboReg y MultiStackReg, mientras que MultiHyperStackReg puede aplicar a un hiperstack cualquier tipo de transformación en caso de que el usuario lo necesite. Las versiones futuras implementarán estas funciones y estarán disponibles en GitHub30. Por último, nuestra macro de líneas giratorias puede ser una forma fácil de medir rápidamente las señales corticales en lapsos de tiempo, incluso si la corteza cambia su posición u orientación con el tiempo. Si su modo de seguimiento o su modo de no seguimiento es el más adecuado para el análisis depende de la calidad y consistencia de la señal cortical. El modo de seguimiento es más fácil de usar, ya que el usuario no necesita considerar dónde estará la corteza para cada punto de tiempo y puede acomodar grandes cambios de posición y orientación con el tiempo. Sin embargo, sólo es adecuado si la señal cortical sigue siendo lo suficientemente fuerte para su detección durante toda la película: una falla en la detección de cualquier otra cosa que no sea la corteza (por ejemplo, un compartimento citoplasmático brillante cerca de la corteza) puede comprometer la detección para cada punto de tiempo siguiente (por ejemplo, el compartimento citoplasmático se aleja de la corteza y las líneas corticales pueden seguirlo durante el resto del lapso de tiempo). El modo de no seguimiento no tiene este escollo, ya que la detección se limita a la línea dibujada originalmente por el usuario (por ejemplo, un compartimento citoplasmático brillante puede hacer que la detección falle durante unos pocos puntos de tiempo, pero a medida que el compartimento citoplasmático se aleja de la zona de detección, se reanuda la detección adecuada de la corteza), pero no se comporta bien si la posición o orientación de la corteza cambia mucho con el tiempo. La siguiente característica (que estará disponible en GitHub30)que se desarrollará para el modo de seguimiento será la opción de analizar solo los puntos de tiempo especificados y definir un punto de tiempo de referencia (en lugar del primer punto de tiempo) antes del cual y después de lo cual se realizará la detección, lo que permitirá al usuario al menos evitar puntos de tiempo problemáticos.

Drosophila sigue siendo un importante sistema modelo para estudiar una amplia gama de cuestiones biológicas y ha destacado en el avance del conocimiento en muchas disciplinas durante décadas. Una característica que lo hace particularmente destacado es que es especialmente adecuado para imágenes en vivo. La capacidad de monitorear los procesos subcelulares o el comportamiento de las células y los tejidos en tiempo real sigue contribuyendo a generar conceptos clave relevantes para la biología celular y del desarrollo. Muchos protocolos exitosos han sido desarrollados por diferentes grupos para mantener vivas y saludables estas muestras de Drosophila para estudiar el comportamiento de la muestra y las moléculas fluorescentes. Órganos y tejidos de la mosca como discos imaginales1,2,el cerebro larvario3,4,5,6,o cámaras de huevos de hembras adultas7,8,9,o el intestino adulto10 por ejemplo pueden ser extraídos y mantenidos en cultivo para imágenes con microscopía de lapso de tiempo. Un desafío clave para la toma de imágenes en vivo es asegurar que la muestra se mantenga cerca de la superficie de imágenes para una resolución óptima e inmóvil sin comprometer la integridad de la muestra que puede ser sensible a los impactos mecánicos. Para estudiar las células madre neuronales, llamadas neuroblastos o neuronas en el cerebro larvario de Drosophila, por ejemplo, mantener muestras cerca de la superficie de imágenes se puede lograr cubriéndolas con medios de cultivo en cámaras de imágenes selladas11,12,13. Sin embargo, este enfoque no permite fácilmente el intercambio de medios, lo que limita el margen de maniobra experimental. Alternativamente, las muestras se pueden preparar y colocar en coverslips tratados para aumentar la adherencia de las células y permitir la microscopía de visita multipunto y imágenes extendidas de células vivas en platos de cultivo abierto, que potencialmente permiten el intercambio de medios, pero no proporcionan medios fáciles para prevenir la deriva o pérdida de la muestra durante el intercambio de medios14,15.
El método de coágulo de Fibrin desarrollado originalmente para estudiar la meiosis en espermatozoides vivos de mosca de la grulla16 es específicamente adecuado para superar estos problemas. Fibringen se disuelve en un medio de cultivo relevante, las muestras colocadas y orientadas en una gota de esta solución en una cámara de imágenes de superficie de vidrio adecuada antes de que se agregue trombina, lo que resulta en la rápida formación de un coágulo de fibrina insoluble, una malla fibrosa pegajosa que se adhiere a la superficie de vidrio y las muestras al tiempo que garantiza el acceso de la muestra al medio de cultivo. A continuación, el medio se puede intercambiar sin perturbar el coágulo o la posición de la muestra. El intercambio medio de cultivo durante la toma de imágenes es, por ejemplo, deseable cuando se deben agregar inhibidores como en el método original o para experimentos de lavado o persecución de pulsos o cuando se añadirán colorantes fluorescentes durante las imágenes celulares vivas mientras se mantienen las células y los tejidos en su lugar. Los coágulos de fibrina son adecuados para la toma de imágenes de tejidos de Drosophila, así como células individuales13,17. Los coágulos de fibrina se pueden utilizar aún más para ayudar a orientar las muestras, que debido a su forma u otras propiedades normalmente no estarían orientados de la manera deseada mediante la modulación de la posición de la muestra dentro del coágulo de Fibrin y la forma del coágulo en sí.
Aquí proporcionamos una actualización sobre nuestros métodos actuales de imágenes basadas en coágulos de Fibrin y proporcionamos herramientas para el análisis de imágenes basado en segmentación y nos centramos en el uso de este método para estudiar las divisiones de neuroblastos en el cerebro mosca en desarrollo. Utilizamos rutinariamente el método de coágulo de Fibrin para seguir múltiples muestras en diferentes coágulos en el mismo plato de cultivo. Esto permite i) imágenes de eventos subcelulares como el comportamiento centroscósmico o la localización de ARNm en vivo18,19, ii) monitoreando el comportamiento de las muestras tras el tratamiento farmacológico de diferentes genotipos bajo la misma configuración de imágenes utilizando visitas multipunto microscopía20, iii) estudiar los efectos de la inhibición aguda de las enzimas21 y iv) minimizando la deriva para estudiar los cambios en la orientación de la división celular de las células dentro de su entorno fisiológico sobre la ablación láser dirigida22. Mientras que los efectos no deseados de trombina y fibrinógeno y el coágulo de Fibrin necesitan ser probados empíricamente para cada muestra, este método es en principio adecuado para inmovilizar cualquier tipo de muestra que deba ser analizada por imágenes de células vivas y en Drosophila se ha utilizado con éxito para estudiar múltiples aspectos de la biología de neuroblastos5,19,20,pero también la dinámica de las proyecciones de citosensores de las células madre de la línea germinal femenina23 y los cambios en la polaridad tras la inhibición aguda de las células folículos de las cámaras de huevos femeninos Drosophila 21.
Las imágenes fluorescentes de lapso de tiempo se traducen en la generación de conjuntos de datos 3D resueltos en el tiempo complejos que requieren métodos para extraer esta información cuantitativa. Aquí describimos nuestro desarrollo adicional de24 macros basadas en ImageJ que se pueden utilizar para corregir la deriva en hiperstacks y macros ImageJ hechas a medida que permiten la cuantificación semiautomática de fluorescencia multicanal en la corteza celular desarrollada para cuantificar proteínas corticales en neuroblastos de cerebros larvarios de Drosophila o de neuroblastos individuales en el cultivo celular primario.

<table><tbody><tr><td>Albumin bovine serum, BSA</td><td>Merck</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovie Serum, suitable for cell culture</td><td>Sigma</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogen from human plasma</td><td>Sigma</td><td>F3879</td><td></td></tr><tr><td>FluoroDish Cell Culture Dish - 35mm, 23 mm well</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>PP1 Analog (1NA-PP1)</td><td>Merck Millipore</td><td>529579</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex spot plate with nine depressions</td><td>Sigma</td><td>CLS722085-18EA</td><td></td></tr><tr><td>Schneider&#039;s Insect Medium</td><td>Sigma</td><td>S0146</td><td></td></tr><tr><td>Thrombin from bovine plasma</td><td>Merck</td><td>T4648</td><td></td></tr></tbody></table>

applications of immobilization of drosophila tissues with fibrin clots for live imaging

Drosophila es un sistema modelo importante para estudiar una amplia gama de cuestiones biológicas. Varios órganos y tejidos de diferentes etapas de desarrollo de la mosca como discos imaginales, las cámaras larvarias del cerebro o del óvulo de las hembras adultas o el intestino adulto se pueden extraer y mantener en cultivo para la toma de imágenes con microscopía de lapso de tiempo, proporcionando información valiosa sobre la biología celular y del desarrollo. Aquí, describimos en detalle nuestro protocolo actual para la disección de los cerebros larvarios de Drosophila, y luego presentamos nuestro enfoque actual para inmovilizar y orientar cerebros larvarios y otros tejidos en un tubo de cubierta de vidrio usando coágulos de Fibrin. Este método de inmovilización sólo requiere la adición de Fibrinógeno y Trombina al medio de cultivo. Es adecuado para imágenes de lapso de tiempo de alta resolución en microscopios invertidos de múltiples muestras en el mismo plato de cultivo, minimiza la deriva lateral con frecuencia causada por los movimientos de la etapa del microscopio en microscopía visitante multipuntos y permite la adición y eliminación de reactivos durante el transcurso de la toma de imágenes. También presentamos macros hechas a medida que usamos rutinariamente para corregir la deriva y extraer y procesar información cuantitativa específica del análisis de lapso de tiempo.

Inmovilización de los tejidos de Drosophila con coágulos de fibrina e intercambio medio de cultivo durante las imágenes en vivo. Después de ser diseccionados siguiendo el procedimiento presentado en el paso 2(Figura 1)e inmovilizados en coágulos de Fibrin en el mismo control de cubiertas después del procedimiento presentado en el paso 3(Figura 2),cerebros larvarios que expresan Bazooka etiquetado por GFP (Baz::GFP), el ortolog mosca de la proteína de polaridad Par-3, fueron imaginados durante 30 minutos en imágenes confocales de lapso de tiempo. Baz::GFP se combina con apkcas4,un alelo que permite la inhibición aguda de la proteína atípica quinasa C (aPKC) a través de la adición del pequeño analógico ATP 1-NAPP120. 1-NAPP1 se añadió al medio de cultivo después del procedimiento presentado en el paso 4 y se reanudaron las imágenes en vivo para las 2,5 h. Los cerebros de control que llevaban una versión de tipo salvaje de la quinasa aPKC no reaccionaron al análogo ATP, mientras que los cerebros portadores además de una mutación analógica sensible de aPKC(apkcas4) mostraron una contracción del neuroepithelium y grupos brillantes de Baz en neuroblastos y su progenie(Figura 6, Video 1). Los neuroblastos siguen dividiéndose a lo largo del lapso de tiempo, lo que indica que el tejido permanece sano, y los cerebros muestran poca deriva a pesar del cambio medio del cultivo, lo que indica que están bien inmovilizados. Del mismo modo, tras ser diseccionados tras el procedimiento presentado enel año 27,se inmovilizaron los coágulos de Fibrin en el mismo control de portadas e imágenes durante 8 minutos, tras lo cual la aplicación de 1-NAPP1 indujo la contracción de apkccomo4 células foliculares mutantes pero no de controles(Figura 7, Vídeo 2).
Corrección de deriva lateral y de enfoque mediante MultiHyperstackReg. Un hiperstack que muestra la deriva lateral y de enfoque(Video 3,panel izquierdo) se corrigió primero para la deriva lateral (paso 6.2, Figura 3, Video 3,panel central), luego deriva de enfoque (paso 6.3, Figura 4, Video 3,panel derecho) utilizando el plugin MultiStackReg y la macro MultiHyperstackReg, lo que resulta en una reducción sustancial de los movimientos observados en el hiperstack original.
Medición de señal cortical utilizando líneas giratorias Un neuroblasto que expresa Baz::GFP (verde) y la proteína transmembrana CD4 etiquetada con una proteína fluorescente infrarroja (CD4::mIFP, rojo) se imaginaron durante una mitosis. La señal CD4::mIFP se utilizó como referencia para detectar la corteza en varias partes del neuroblasto con linescans (paso 7, Figura 5, Figura 8A-C)y la señal Baz::GFP se midió en las posiciones detectadas Figura 8D). Durante su división, los neuroblastos se polarizaron transitoriamente estableciendo dominios corticales distintos y opuestos: el polo apical y el polo basal. Baz define el polo apical y, consistentemente, la señal Baz::GFP aumentó en el polo apical del neuroblasto y disminuyó en el polo basal durante la división(Figura 8C,D). La posición de la corteza fue rastreada satisfactoriamente durante todo el lapso de tiempo (Figura 8C, Video 4). Se hace referencia a las líneas y genotipos de Drosophila en la Tabla suplementaria 1–2.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig06.jpg"> Figura 6: Aplicación de un análogo ATP en cerebros larvarios inmovilizados durante imágenes en vivo. (A) Imágenes en vivo de dos cerebros larvarios que expresan Baz::GFP inmovilizado en la misma portada. El medio de cultivo se cambia a una concentración de 10 μM del analógico ATP 1-NAPP1 a 0 min. Los cerebros de control no reaccionan visiblemente al análogo ATP, mientras que los cerebros portadores de una mutación sensible analógica de aPKC(aPKCAS4)muestran una contracción del neuroepithelium (puntas de flecha) y grupos brillantes de Baz en neuroblastos y su progenie. Proyección de intensidad máxima de 33 rebanadas para una profundidad de 23 μM. Barra de escala: 20 μM. (B) Ampliación del neuroepithelium. Barra de escala: 10 μM. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61954/61954fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig07.jpg"> Figura 7: Aplicación de un análogo ATP en cámaras de huevos inmovilizadas durante imágenes en vivo. Imagen en vivo de dos ovarioles que expresan Baz::GFP inmovilizado en el mismo coverslip. El medio de cultivo se cambia a una concentración de 10 μM del analógico ATP 1-NAPP1 a 0 min. Las cámaras de huevos de control no reaccionan visiblemente al análogo ATP, mientras que las cámaras de huevos que llevan una mutación sensible analógica de aPKC(aPKCAS4)muestran una contracción del epitelio (puntas de flecha) que eventualmente conduce a la aparente descomposición de las uniones de adherentes. Proyección de intensidad máxima de 33 rebanadas para una profundidad de 27 μM. Escala bar: 20 μM. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61954/61954fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig08.jpg"> Figura 8: Medición de la señal cortical utilizando linescans giratorios. (A) Neuroblast D. melanogaster en vivo que expresa Baz::GFP (verde) y CD4::mIFP (rojo). Líneas de cian: líneas de escaneo inicial trazadas perpendicularmente a varias zonas corticales a medir. Barra de escala: 5 μM. (B) Identificación de la corteza (línea azul oscuro) utilizando linescans corticales y CD4::mIFP (rojo) como canal de referencia. Línea de cian: área definida por el parámetro "Medir alrededor" (aquí, 2 píxeles), donde la señal se mide después de la detección de la corteza. Barra de escala: 2 μm. (C) Cian: áreas corticales identificadas durante una división de neuroblasto por el método de linescans giratorios a partir de las líneas de escaneo iniciales mostradas en (A), utilizando CD4::mIFP (rojo) como canal de referencia. Barra de escala: 5 μM. Flecha: polo apical. Punta de flecha: polo basal. (D) Medición de la intensidad de la señal Baz::GFP a lo largo del tiempo en las dos zonas correspondientes identificadas por las líneas giratorias en las que se muestran (C). Durante la mitosis, Baz::GFP se enriquece transitoriamente en el polo apical del neuroblasto y se agota desde el polo basal opuesto. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61954/61954fig08large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Vídeo 1: Aplicación del intercambio de medios en cerebros larvarios inmovilizados durante imágenes en vivo para añadir un inhibidor, presentado en la Figura 6,barra de escala: 20 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_1_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para descargar este video.</a>
Video 2: Aplicación del intercambio de medios en cámaras de huevos inmovilizadas durante imágenes en vivo para añadir un inhibidor, presentado en la Figura 7,barra de escala: 20 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_2_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">Por favor haga clic aquí para descargar este video.</a>
Vídeo 3: Corrección de la deriva lateral y de enfoque mediante MultiHyperStackReg. Imágenes en vivo de un neuroblasto que expresa la sonda de membrana PH::GFP. Xy: plano focal único. Xz: reslice ortogonal. Izquierda: antes de la corrección de la deriva. Medio: después de la corrección de la deriva lateral. Derecha: después de la corrección de la deriva lateral y de enfoque, barra de escala: 10 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_3_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para descargar este video.</a>
Video 4: Detección de la corteza utilizando linescans giratorios, presentados en la Figura 8,escala de barra: 5 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_4_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para descargar este video.</a>
Tabla suplementaria 1: Genotipos de tejidos Drosophila en imágenes. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Supplemental_Table_1_genotypes.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Tabla suplementaria 2: Origen de los transgéneos utilizados. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Supplemental_Table_2_origine_of_transgenes.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Archivo de codificación suplementario 1: Origen de los transgéneos utilizados. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code1_MultiHyperstackReg.ijm" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo de codificación suplementario 2: Origen de los transgéneos utilizados. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code2_AutoHyperstackReg.ijm" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo de codificación suplementario 3: Origen de los transgéneos utilizados. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code3_RotatingLineScan.ijm" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

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Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

Este protocolo describe las aplicaciones de la inmovilización de muestras utilizando coágulos de Fibrin, limitando la deriva y permitiendo la adición y lavado de reactivos durante las imágenes en vivo. Las muestras se transfieren a una gota de Fibrinógeno que contiene medio de cultivo en la superficie de un deslizamiento de cubierta, después de lo cual la polimerización se induce añadiendo trombina.

Aplicaciones de inmovilización de tejidos de Drosophila con coágulos de fibrina para imágenes vivas

Drosophila is an important model system to study a vast range of biological questions. Various organs and tissues from different developmental stages of ...

applications-immobilization-drosophila-tissues-with-fibrin-clots-for

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

3.0K vistas.  University of Dundee. Este protocolo describe las aplicaciones de la inmovilización de muestras utilizando coágulos de Fibrin, limitando la deriva y permitiendo la adición y lavado de reactivos durante las imágenes en vivo. Las muestras se transfieren a una gota de Fibrinógeno que contiene medio de cultivo en la superficie de un deslizamiento de cubierta, después de lo cual la polimerización se induce añadiendo trombina.

Video: Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of the Drosophila larva makes it an attractive model organism for live imaging studies. However, an important challenge for live imaging techniques is to noninvasively immobilize and position an animal on the microscope. This protocol presents a simple and easy to use method for immobilizing and imaging Drosophila larvae on a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device, which we call the 'larva chip'. The larva chip is comprised of a snug-fitting PDMS microchamber that is attached to a thin glass coverslip, which, upon application of a vacuum via a syringe, immobilizes the animal and brings ventral structures such as the nerve cord, segmental nerves, and body wall muscles, within close proximity to the coverslip. This allows for high-resolution imaging, and importantly, avoids the use of anesthetics and chemicals, which facilitates the study of a broad range of physiological processes. Since larvae recover easily from the immobilization, they can be readily subjected to multiple imaging sessions. This allows for longitudinal studies over time courses ranging from hours to days. This protocol describes step-by-step how to prepare the chip and how to utilize the chip for live imaging of neuronal events in 3rd instar larvae. These events include the rapid transport of organelles in axons, calcium responses to injury, and time-lapse studies of the trafficking of photo-convertible proteins over long distances and time scales. Another application of the chip is to study regenerative and degenerative responses to axonal injury, so the second part of this protocol describes a new and simple procedure for injuring axons within peripheral nerves by a segmental nerve crush.

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are an attractive model system for live imaging due to their translucent cuticle and powerful genetics. This protocol describes how to utilize a single-layer PDMS device, called the &#39;larva chip&#39; for live imaging of cellular processes within neurons of 3rd instar Drosophila larvae.

El uso de chips de microfluídica para imágenes en vivo y de estudio de las respuestas de lesiones en<em&gt; Drosophila</em&gt; Las larvas

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

Investigación

Bioingeniería

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle synapses, we developed a larval tissue preparation that had features of live intact larvae, but also had good optical properties.  This new preparation also allowed for access of perfusates to the synapse.  We used fly larvae, immersed them in artificial hemolymph, and relaxed their normal rhythmic body contractions by chilling them. Next we dissected off the posterior segments of each animal and with a blunt insect pin pushed the mouth parts backward through the body cavity.  This everted the larval body wall, like turning a sock inside-out.  We completed the dissection with ultra-fine dissection scissors and thus exposed the visceral side of the body wall muscles. The glial structures at the NMJ expressed membrane targeted GFP under the control of glial specific promoters. The post-synaptic membrane, the SSR (Subsynaptic Reticula) in muscle expressed synaptically targeted dsRed. We needed to acutely label the motor neuron terminals, the third part of the synapse. To do this we applied primary antibodies to HRP, conjugated to a far-red emitting flurophore.  To test for dye diffusion properties into the perisynaptic space between the motor neuron terminals and the SSR, we applied a solution of large Dextran molecules conjugated to far-red emitting flurophore and collected images.

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

We described structural features of the Glia-neuromuscular synapses in a novel Inside-out tissue preparation of live fly larvae using fluorescent dyes with confocal microscopy. We labeled live neuron terminals with fluorescent primary antibodies to HRP, and also visualized the perisynaptic space with fluorescent Dextrans.

Visualizar el vivo Drosophila Gliales-unión neuromuscular con tintes fluorescentes

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle ...

Biología

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

La preparación de los Drosophila Los embriones para Live-Imaging utilizando el protocolo de gota

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Imágenes en directo de Drosophila melanogaster Migraciones hemocitos embrionarias

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

Preparación de desarrollo y de adultos Drosophila Los cerebros y retinas de imágenes en vivo

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal lines have enabled biological processes to be studied in the context of a living, and in some instances even behaving, organism. In this protocol we will describe how to anesthetize intact Drosophila larvae, using the volatile anesthetic desflurane, to follow the development and plasticity of synaptic populations at sub-cellular resolution1-3. While other useful methods to anesthetize Drosophila melanogaster larvae have been previously described4,5,6,7,8, the protocol presented herein demonstrates significant improvements due to the following combined key features: (1) A very high degree of anesthetization; even the heart beat is arrested allowing for lateral resolution of up to 150 nm1, (2) a high survival rate of &gt; 90% per anesthetization cycle, permitting the recording of more than five time-points over a period of hours to days2 and (3) a high sensitivity enabling us in 2 instances to study the dynamics of proteins expressed at physiological levels. In detail, we were able to visualize the postsynaptic glutamate receptor subunit GluR-IIA expressed via the endogenous promoter1 in stable transgenic lines and the exon trap line FasII-GFP1. (4) In contrast to other methods4,7 the larvae can be imaged not only alive, but also intact (i.e. non-dissected) allowing observation to occur over a number of days1. The accompanying video details the function of individual parts of the in vivo imaging chamber2,3, the correct mounting of the larvae, the anesthetization procedure, how to re-identify specific positions within a larva and the safe removal of the larvae from the imaging chamber.

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

This protocol describes a reliable method for anesthetization and imaging of intact Drosophila melanogaster larvae. We have utilized the volatile anesthetic desflurane to allow for repetitive imaging at sub-cellular resolution and re-identification of structures for up to a few days1.

Imágenes in vivo de larvas de Drosophila intactos a nivel sub-celular Resolución

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. Single-molecule imaging is gaining momentum as it provides exceptional access to the visualization of individual molecules in living cells. Here, we describe a technique that we developed to perform single-particle tracking photo-activated localization microscopy (sptPALM) in Drosophila larvae. Synaptic communication relies on key presynaptic proteins that act by docking, priming, and promoting the fusion of neurotransmitter-containing vesicles with the plasma membrane. A range of protein-protein and protein-lipid interactions tightly regulates these processes and the presynaptic proteins therefore exhibit changes in mobility associated with each of these key events. Investigating how mobility of these proteins correlates with their physiological function in an intact live animal is essential to understanding their precise mechanism of action. Extracting protein mobility with high resolution in vivo requires overcoming limitations such as optical transparency, accessibility, and penetration depth. We describe how photoconvertible fluorescent proteins tagged to the presynaptic protein Syntaxin-1A can be visualized via slight oblique illumination and tracked at the motor nerve terminal or along the motor neuron axon of the third instar Drosophila larva.

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Here we illustrate how single molecule photo-activated localization microscopy can be carried out on the motor nerve terminal of a live Drosophila melanogaster third instar larva.

En Vivo Una sola molécula de seguimiento en la Terminal presináptica del nervio Motor del Drosophila

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

Neurociencias

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. The molecular clock within each pacemaker neuron generates circadian rhythms in gene expression, which underlie the rhythmic neuronal functions essential to the operation of the circuit. Investigation of the properties of the individual molecular oscillators in different subclasses of pacemaker neurons and their interaction with neuronal signaling yields a better understanding of the circadian pacemaker circuit. Here, we present a time-lapse fluorescent microscopy approach developed to monitor the molecular clockwork in clock neurons of cultured Drosophila larval brain. This method allows the multi-day recording of the rhythms of genetically encoded fluorescent circadian reporters at single-cell resolution. This setup can be combined with pharmacological manipulations to closely analyze real-time response of the molecular clock to various compounds. Beyond circadian rhythms, this multipurpose method in combination with powerful Drosophila genetic techniques offers the possibility to study diverse neuronal or molecular processes in live brain tissue.

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The goal of this protocol is to establish ex vivo Drosophila larval brain culture optimized to monitor circadian molecular rhythms with long-term fluorescence time-lapse imaging. The application of this method to pharmacological assays is also discussed.

Sola célula resolución fluorescencia vivo la proyección de imagen de relojes circadianos de Drosophila en cerebro larvas cultura

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

Imágenes en directo de las proteínas GFP-etiquetados en<em&gt; Drosophila</em&gt; Los ovocitos

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because the larval body wall and most internal organs are transparent. However, continuous live imaging of intact Drosophila larvae for longer than 30 min has been challenging because it is difficult to noninvasively immobilizeimmobilizing larvae for a long time. Here we present a larval mounting method called LarvaSPA that allows for continuous imaging of live Drosophila larvae with high temporal and spatial resolution for longer than 10 hours. This method involves partially attaching larvae to the coverslip using a UV-reactive glue and additionally restraining larval movement using a polydimethylsiloxane (PDMS) block. This method is compatible with larvae at developmental stages from second instar to wandering third instar. We demonstrate applications of this method in studying dynamic processes of Drosophila somatosensory neurons, including dendrite growth and injury-induced dendrite degeneration. This method can also be applied to study many other cellular processes that happen near the larval body wall.

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

This protocol describes a method for mounting Drosophila larvae to achieve longer than 10 h of uninterrupted time-lapse imaging in intact live animals. This method can be used to image many biological processes close to the larval body wall.

LarvaSPA, un método para montar larvas de Drosophila para imágenes de lapso de tiempo a largo plazo

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because ...

Aplicaciones de inmovilización de tejidos de Drosophila con coágulos de fibrina para imágenes vivas

Resumen

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Capítulos en este video

El uso de chips de microfluídica para imágenes en vivo y de estudio de las respuestas de lesiones en