El protocolo actual muestra en detalle la administración subretiniana de todos los organoides retinianos en un modelo animal grande, con el objetivo de desarrollar enfoques de terapia celular para la degeneración de la retina. La principal ventaja de esta técnica es que permite la entrega de organoides directamente al tejido diana, la retina. La técnica tiene como objetivo tratar afecciones degenerativas retinianas cegadoras avanzadas, como la degeneración macular relacionada con la edad, la retinitis pigmentosa o la amaurosis congénita de Leber.
Demostrando el procedimiento estará el Dr. Peterson Jones. Para la implantación subretiniana de los organoides, use las tijeras de tenotomía Stevens para realizar una cantotomía lateral de 0,5 a 1 centímetro en un gato anestesiado en ayunas durante la noche de cuatro meses de edad, y coloque un espéculo de párpado Barraquer del tamaño adecuado en la incisión para mantener los párpados abiertos con un asistente quirúrgico que irriga regularmente la córnea con BSS durante todo el procedimiento. Use fórceps de atado corneal Castroviejo 0.5 y un pequeño hemostático de mosquito para agarrar suavemente la conjuntiva bulbar junto al limbo.
Coloque dos suturas de seda 6-0 en la conjuntiva inmediatamente adyacente al limbo en las posiciones de las 4 y 8 en punto para sostener el ojo en la mirada primaria y retraer el tercer párpado. Sujete los extremos de las suturas con pequeños hemostáticos de mosquitos para ayudar a su manipulación, y coloque otra sutura en la posición de las 12 en punto en el limbo parcialmente a través del grosor del limbo, teniendo cuidado de no penetrar en el ojo. Anude libremente la sutura, cortando el extremo corto, y coloque una sutura de estancia en la conjuntiva inmediatamente adyacente al limbo en la posición de las 4 en punto para sostener el ojo y la mirada primaria.
Refleje la conjuntiva bulbar entre las 10 y las 2 en punto, y use tijeras de tenotomía para incidir la conjuntiva a dos o tres milímetros del limbo. Socave la conjuntiva y despeje la cápsula de Denon para exponer la esclerótica en los sitios del puerto de vitrectomía a las dos y 10 en punto, de tres a cinco milímetros del limbo. Use calibradores para identificar los sitios para la esclerotomía, evitando los principales vasos esclerales que pueden ser prominentes en el gato.
Planificación para una región de tres milímetros en el puerto de instrumentos de las 10 en punto para un cirujano diestro, pre-coloque suturas de patrón cruzado de poliglactina 6-0 o 7-0 sin atar en los sitios de las esclerotomías propuestas. Una vez que las suturas estén en su lugar, haga que el asistente agarre las suturas de estadía de las 12 en punto para ayudar a mantener el globo en posición, y use pinzas Castroviejo de 0.12 milímetros para sostener el tejido junto al sitio de la esclerotomía. Utiliza un trócar para introducir un puerto de vitrectomía de calibre 23 a través de la esclerótica en las posiciones de las 2 y 10 en punto en ángulo hacia el nervio óptico para evitar el contacto con la lente, y use pinzas de atado para empujar suavemente el puerto de irrigación para determinar si las puntas se pueden visualizar dentro del vítreo.
Haga que el asistente coloque una lente de vitrectomía de irrigación Machemer en la córnea para permitir la visualización del segmento posterior del ojo, y un cortador de sonda de vitrectomía de calibre 23 a través del puerto del instrumento para realizar una vitrectomía central parcial. A continuación, introduzca la aguja de una jeringa de un mililitro que contiene un mililitro de solución de triamcinolona en el puerto del instrumento e inyecte de 250 a 500 microlitros de la suspensión de cristal. Cuando se haya administrado la solución, avance la sonda de vitrectomía a través del puerto del instrumento para cerrar la cabeza del nervio óptico con el puerto orientado hacia la superficie de la retina.
Use alto vacío para ayudar a separar la cara vítrea de la retina, inserte el inyector a través del puerto del instrumento hacia la superficie de la retina y extruya la punta de la cánula. Presione suavemente la punta de la superficie de la retina y haga que el asistente dé un ligero empujón rápido sobre el émbolo de la jeringa para iniciar el desprendimiento de retina, reduciendo la presión de inyección para permitir un aumento lento del desprendimiento de retina hasta que se alcance el tamaño deseado. Use una cánula de calibre 41 del inyector para agrandar ligeramente el desprendimiento hasta que se puedan introducir tijeras retinianas y retire el puerto escleral de las 10 en punto.
Luego use un cuchillo recto de 2.850 milímetros orientado hacia el nervio óptico para evitar tocar la lente para agrandar la esclerotomía en este sitio. Haga la retinotomía en la ampolla lejos del nervio óptico para evitar dañar las fibras nerviosas de la retina que se originan en la región trasplantada, y evite cortar los vasos retinianos principales para reducir el riesgo de hemorragia. Para implantar los organoides, inserte un capilar de vidrio cargado con organoides a través de la esclerotomía agrandada hacia el sitio de la retinotomía, y use la punta del capilar para abrir ligeramente la retinotomía para permitir el acceso a la abertura de la ampolla subretiniana.
Haga que el asistente presione lentamente el émbolo del inyector nuevamente para inyectar los organoides en la ampolla subretiniana. BSS debe proceder organoides, los órganos, y enjuagar la retinotomía abierta. Cuando se hayan entregado todos los organoides, deje el capilar de vidrio en su lugar durante unos segundos antes de retirar lentamente el capilar del ojo, teniendo cuidado de evitar cualquier liberación repentina de líquido.
Cuando se haya extirpado el capilar, cierre la esclerotomía con la sutura precolocada en un patrón cruzado. Haga que el asistente retire el puerto de infusión y ate rápidamente la sutura de esclerotomía y cierre la peritomía con las suturas de poliglactina en un patrón continuo simple. Cierre la cantotomía lateral con una sutura de poliglactina 6-0 y suturas cutáneas en forma de ocho para realizar el canto lateral y use suturas simples de piel interrumpida para cerrar el resto de la herida.
Luego administre el cóctel de esteroides y antibióticos postquirúrgicos apropiado. La carga de organoides retinianos derivados de células madre pluripotentes humanas puede confirmarse dentro de la cánula de vidrio del dispositivo de inyección y durante la cirugía mediante visualización directa. La presencia de los organoides dentro del espacio subretiniano puede confirmarse postoperatoriamente mediante examen oftalmológico e imágenes de fondo de ojo.
Antes de la eutanasia, también se puede realizar una oftalmoscopia láser de barrido confocal y una tomografía de coherencia óptica de dominio espectral para evaluar la posición de los organoides. Estas técnicas se pueden utilizar para demostrar la persistencia de organoides retinianos en el espacio subretiniano entre la retina neural y el epitelio pigmentario de la retina del ojo receptor. Los análisis histológicos e inmunohistoquímicos se pueden utilizar para ilustrar la supervivencia de los gráficos xenogénicos dentro del espacio subretiniano de un ojo grande en un animal inmunodeprimido.
Solo aquellos expertos en cirugía vitreorretiniana, como oftalmólogos veterinarios capacitados o cirujanos vitreorretinianos familiarizados con las diferencias de especies en el ojo de gato en comparación con el ojo humano deben realizar este procedimiento. La técnica presentada en este video debe ser aplicable a otros modelos de animales grandes que se utilizan para traducir las técnicas quirúrgicas vitreorretinianas a las clínicas.
