El protocolo demostrado en este vídeo nos permite comprender el papel de los metabolitos intestinales en la morfogénesis hipófística fúngica. Esta técnica ex vivo más o menos la aproximación más cercana del intestino para el estudio de la morfogénesis hipófal fúngica de una manera que ningún estudio in vitro puede replicar. Este método se puede aplicar para estudiar el papel de los metabolitos intestinales en otros patógenos entéricos.
Disecciona ratones usando tijeras y fórceps esterilizados autoclavados. Después de la eutanasia, fije el animal a una superficie de disección fijando todas las extremidades para exponer el abdomen. Rocíe la región abdominal con 70% de etanol para evitar que el pelaje se pegue a los fórceps, tijeras o secciones intestinales.
Utilice fórceps para pellizcar y levantar una sección de la piel en la base del abdomen y crear una pequeña incisión a través de la piel y la fascia subyacente teniendo cuidado para evitar perforar el cecum o la pared intestinal. Extienda este corte a la caja torácica exponiendo parcialmente la cavidad peritoneal, luego haga un corte comenzando en el punto de la incisión inicial a cada lado y extendiéndose hacia arriba y lateralmente. Tire de estas aletas lateralmente y anclelas a la superficie de disección para exponer completamente la cavidad peritoneal.
Extraiga el tracto gastrointestinal con fórceps mientras usa tijeras para hacer cortes superiores al estómago y en la región distal del intestino grueso para asegurar la recolección de la mayor cantidad de contenido intestinal. Al retirar el tracto gastrointestinal, tenga cuidado de evitar la rotura de los componentes individuales. Separe el estómago, el intestino delgado, el cecum y el intestino grueso en sus extremos proximal y distal.
Para la recolección de contenido intestinal de cada sección, haga una sola incisión en el extremo distal, luego expulse manualmente el contenido intestinal en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros con fórceps. Almacene las muestras a menos 80 grados centígrados para ensayos ex vivo. Raya un nuevo cultivo de C.albicans SC5314 en una placa de agar YPD e incuba durante la noche a 30 grados centígrados.
Al día siguiente, escoge dos o tres colonias individuales de tamaño mediano y resuspendlas en un mililitro de PBS. Recupera el contenido de las tripas congeladas del congelador y descongela a 25 grados centígrados. Transfiera aproximadamente 150 miligramos de contenido intestinal a un nuevo tubo de 1,5 mililitros y resuspendándolos con 150 microlitros de PBS.
Vórtice la muestra a alta velocidad durante 30 segundos para homogeneizar el contenido intestinal y permitir que se siente a temperatura ambiente durante aproximadamente un minuto. Centrifugar los homogeneiza a 1.000 veces G durante tres minutos, luego transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 mililitros teniendo cuidado de no transferir ningún escombro. Después de repetir la centrifugación, agregue 10 microlitros del C.albicans inoculum al sobrenadante, mezcle bien e incubar la muestra a 37 grados centígrados durante cuatro a cinco horas.
Para probar el efecto de los metabolitos exógenos en C.albicans, añadir la concentración deseada de metabolitos al contenido intestinal y la mezcla de PBS, luego vórtice la muestra a alta velocidad durante 30 segundos, dejarla reposar a temperatura ambiente durante 10 minutos, y realizar centrifugación e inoculación como se describió anteriormente. Centrifugar el cultivo de células fúngicas a 1.000 veces G durante dos minutos y deseche el sobrenadante. Fijar las muestras en 100 microlitros de 2%PFA durante 15 minutos, luego repetir la centrifugación y desechar el sobrenadante.
Lave las muestras dos veces con un mililitro de PBS de acuerdo con las instrucciones del manuscrito, luego incubar las muestras a temperatura ambiente en 100 microlitros de PBS con anticuerpo policlonal C.albicans durante 30 minutos. Después de la incubación, lave la muestra tres veces más con PBS, trabajando a poca luz para evitar el fotoblanquido. En una habitación oscura, incubar las muestras a temperatura ambiente durante 15 minutos en 100 microlitros de PBS que contienen anticuerpos anti-conejo IgG Alexa Fluor 488 en una dilución de uno a 500.
Después de lavar la muestra tres veces con un mililitro de PBS, resuspendirlo en 100 microlitros de PBS y transferirlo a una placa de 96 pozos para la toma de imágenes. Imbrete las células fúngicas con un microscopio de imágenes de fluorescencia utilizando lentes objetivo 20X y 40X y un filtro de proteína fluorescente verde. Cuando C.albicans se cultiva ex vivo en extractos de homogeneato intestinal tomados del estómago, intestinos delgados e intestinos gruesos de control no tratado y ratones tratados con antibióticos, generalmente se desarrolla con una morfología de levadura.
Sin embargo, Cuando se cultiva en el extracto de cefal de ratones tratados con antibióticos, C.albicans se somete fácilmente a morfogénesis que resulta en formas de levadura e hifas. Esto indica que el tratamiento con antibióticos causa cambios en el entorno cecal, que inducen morfogénesis hifífala de C.Albicans. La adición exógena de glucosa al homogeneato cecal de ratones tratados con antibióticos mostró un desarrollo bombo masivo ex vivo.
Estos resultados sugieren que la adición de metabolitos intestinales al homogeneizado cecal de los ratones tratados con antibióticos regula diferencialmente la morfogénesis de C.albicans. Al intentar este protocolo, tenga en cuenta que la optimización de la dilución del contenido intestinal garantiza la recolección suficiente de metabolitos intestinales sin recolección de residuos. No exceda una dilución de contenido de dos a uno de medios a tripas y apunte a una dilución más baja si es posible.
Esta técnica se utiliza ahora para explorar cómo metabolitos específicos en el desarrollo hifal de impacto intestinal, lo que permite a los investigadores comprender mejor el papel de los metabolitos intestinales en la patogénesis fúngica.
