Este protocolo nos permite la capacidad de aislar linfocitos T de pacientes con la enfermedad para estudios, el defecto molecular y el defecto inmunológico. Este método nos permite aislar células viables, células con las anomalías de la enfermedad para la purificación del ARN, ADN y proteínas de estos pacientes y que nos permite caracterizar defectos moleculares para comprender las anomalías de las vías que son importantes en la patogénesis. Este método es valioso para el aislamiento de sangre periférica que se puede fraccionar aún más para estudiar las células sanguíneas en estados normales, así como las células sanguíneas de enfermedades con anomalías inmunes.
Demostrando este procedimiento estará Alanna, quien es una estudiante de medicina investigadora de mi laboratorio. Después de obtener una muestra de sangre periférica en cinco tubos de 10 mililitros que contienen anticoagulante, transfiera de 10 a 15 mililitros de sangre a tubos de separación de 50 mililitros marcados con el número de sujeto y diluya las muestras al menos dos veces, pero a no más de 35 mililitros por tubo con HBSS. Cuidadosamente y lentamente subyace la sangre con aproximadamente 13 mililitros de medio de densidad por tubo, deteniendo el pipeteo cuando la pipeta está casi vacía para evitar burbujas.
Retire la pipeta lentamente para evitar mezclar las capas de sangre y medio de densidad y transfiera cuidadosamente los tubos de separación llenos a la centrífuga sin perturbar las capas. Después de separar las células por centrifugación, retire todos menos los últimos 10 mililitros del plasma que contiene la capa superior, antes de recoger cuidadosa y lentamente la capa buffy. Agrupe la capa buffy de entre dos tubos de separación en un solo tubo estéril de 50 mililitros etiquetado y diluya el PBMC al menos dos veces con HBSS fresco a un total de 50 mililitros por tubo.
Cuando se hayan recogido todas las capas de buffy, peine las células por centrifugación y retire la mayor cantidad posible del sobrenadante de cada tubo. Golpee el fondo del tubo para aflojar el gránulo y vuelva a suspender los gránulos en uno o dos mililitros de tampón de lisis ACK por volumen de muestra de sangre original de 10 mililitros por tubo. Después de exactamente cinco minutos, detenga la lisis en cada tubo con un volumen igual o mayor de HBSS y ajuste cada volumen a 50 mililitros.
Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante, agrupe las células del mismo donante y lleve el volumen hasta 50 mililitros con HBSS fresco para otra centrifugación. Luego vuelva a suspender las células en 10 mililitros de medio RP 10F de 37 grados Celsius para contar. Para la purificación de células T CD4 +CD45RO +, gire hacia abajo las células y diluya el PBMC a cinco veces 10 a la séptima célula por mililitro de concentración tampón de selección.
Transfiera las células a un tubo de poliestireno de fondo redondo de cinco mililitros y agregue 50 microlitros de cóctel de anticuerpos por cada mililitro de muestra con una mezcla suave. Después de cinco minutos a temperatura ambiente, vórtice partículas magnéticas a alta velocidad durante 30 segundos antes de agregar 50 microlitros de partículas magnéticas por un mililitro de muestra al tubo con una mezcla suave. Lleve el volumen a 2,5 mililitros con un tampón de selección fresco y una mezcla suave y coloque el tubo sobre un imán durante 2,5 minutos.
Al final de la incubación, recoja el imán e invierta el tubo en un movimiento continuo para decantar la suspensión celular enriquecida en un nuevo tubo estéril. Para aumentar la recuperación celular, agregue 2.5 mililitros de tampón de selección al tubo sin perturbar las perlas inmovilizadas para otra incubación de 2.5 minutos en el imán y agregue el lavado al tubo de recolección, luego cuente el número de células viables usando un hemocitómetro y confirme la pureza de la célula por citometría de flujo. Para activar las células, ajuste las células T CD4 + CD45RO + a cinco veces 10 a las sextas células por mililitro de concentración media de 37 grados Celsius RP 10F y sembra las células en platos de cultivo del tamaño adecuado.
Descanse las células en una incubadora humidificada de 37 grados Celsius, 5% de dióxido de carbono durante la noche. A la mañana siguiente, recoja las células descansadas por centrifugación y resuspenda el pellet a una concentración media de cinco veces 10 a la sexta célula por mililitro de 37 grados Celsius RP 10F. Divida la suspensión en cinco a 10 veces alícuotas de 10 a la sexta celda en cada uno de los tres tubos de tapón de rosca estériles y estimule las células en el tubo dos con PMA y el tubo tres con A23187 y mezcla suave.
Agregue un volumen igual de dimetilsulfóxido al primer tubo para que sirva como control del vehículo y coloque los tubos con las tapas aflojadas en la incubadora durante el período de activación apropiado. Al final de la incubación, recoja las células por centrifugación y deseche la mayor cantidad posible del sobrenadante sin alterar el gránulo celular. Luego, lisa las células según las indicaciones de un kit de aislamiento de ARN disponible comercialmente y aísle el ARN de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
La viabilidad y pureza de las células T CD4+CD45RO+obtenidas por este protocolo de selección negativa es consistentemente alta. El rendimiento de las células T CD4+CD45RO+obtenidas de las cámaras del sistema de leucorreducción de los PBMC de la SS suele ser de alrededor del 75% en comparación con aproximadamente el 16% de las PBMC de donantes normales. Las células T de memoria SS y las PBMC de la SS expresaron mal las citoquinas y otros genes de respuesta inmune en comparación con las células de las células T y pbMC de donantes normales.
Además, muchos genes que normalmente no se expresan en las células T de donantes normales se expresan altamente en las células T SS tanto en reposo como después de la estimulación. Una buena técnica estéril y una rutina consistente son realmente importantes para el éxito de esta técnica. También es muy importante mientras superpones el Ficoll que uses una pipeta automática con un control fino y que realmente prestes atención a la velocidad a la que estás colocando el Ficoll.
Las células aisladas utilizando este método serán viables y se pueden utilizar para estudios de toxicidad, estudios bioquímicos moleculares para la caracterización de vías de transducción de señales, citometría de flujo y estudios de expresión génica. El método se puede utilizar para aislar células de pacientes con enfermedad, para enfermedades inflamatorias y también otras enfermedades como el cáncer para estudios directos. Ejemplos de estas enfermedades incluyen psoriasis y dermatitis atópica.
