En este protocolo, describimos un método simple para fabricar un dispositivo basado en papel llamado XO Pad, que está diseñado para el enriquecimiento efectivo en aislamiento de vesículas extracelulares. El XO Pad es un dispositivo simple que puede precontratar y aislar la vesícula extracelular sin el uso de productos químicos o máquinas de trabajo, mientras que muestra tasas de recuperación más altas que los métodos convencionales. Comience definiendo la región que se imprimirán con el software de la impresora.
El diseño debe tener 12 capas con patrón de cera en las que los diámetros de las áreas circulares de la muestra se estrechan gradualmente de cinco a dos milímetros. A continuación, imprima cera hidrófoba en las regiones designadas a ambos lados del papel de celulosa. Coloque el papel impreso en cera en un horno de laboratorio durante 80 segundos a 120 grados Centígrados, luego corte el papel impreso en cera con un cortador para fabricar dispositivos XO Pad individuales.
Suelte un cinco y dos microlitros de membrana selectiva de perm en las áreas de la muestra en la mayoría izquierda y la derecha de la mayoría de las capas, respectivamente. Coloque las capas codificadas con la membrana selectiva perm en una placa caliente a 70 grados Celsius durante 30 minutos para evaporar el disolvente. A continuación, selle la superficie más externa de la capa recubierta frente a la solución tampón con cinta sensible a la presión, dejando un pequeño agujero.
Doble el dispositivo XO Pad de un lado a otro a lo largo de las líneas blancas para conectar convergentemente todas las áreas de muestra. Pipetear 15 microlitros de la microvesícula y la muestra de exosoma en las áreas convergentes de la muestra y esperar unos segundos para asegurar la humectación completa. Coloque dos cámaras de acrílico en ambos extremos de la XO Pad y fíjela firmemente con pequeños clips de aglutinante para evitar que se desdoblen.
Llene las cámaras con 110 microlitros de 0.1X PBS e inserte dos electrodos de plata. A continuación, utilice un sistema de medición de fuente de voltaje de corriente para aplicar 30 voltios a los electrodos durante 20 minutos. Para aislar las microvesículas y exosomas enriquecidos, separe el XO Pad plegado de las cámaras de acrílico y desdoble el dispositivo para aislar las partículas enriquecidas de las otras capas.
Perforar las áreas de muestra en las capas ocho y nueve donde las microvesículas y exosomas se enriquecen para el análisis posterior. Se realizó un ensayo de migración de lapso de tiempo de microvesículas y exosomas con etiqueta fluorescente con el fin de optimizar el tiempo de operación para la máxima recuperación de las partículas enriquecidas. Las intensidades de fluorescencia en todas las áreas de muestra se cuantificaron con el software ImageJ.
Antes del proceso de enriquecimiento, las microvesículas y los exosomas se dispersaron en todas las áreas de la muestra con una disminución gradual de la intensidad. Después de 10 minutos de procesamiento, las partículas migraron electro-fíneticamente y un enchufe de pre-concentración instantánea apareció en la capa siete. Cuando el tiempo llegó a los 20 minutos, las microvesículas y los exosomas se centraban fuertemente en las capas ocho y nueve y enriquecían cinco veces en función de las intensidades de fluorescencia.
La integridad de las microvesículas y exosomas enriquecidos en la capa ocho se investigó con SEM. Sem. Se observaron significativamente más partículas no dañadas después del proceso de enriquecimiento. También se analizó la distribución del tamaño de las microvesículas y exosomas enriquecidos.
Posteriormente, se analizó la concentración real de las microvesículas y exosomas enriquecidos en las áreas de muestra en las capas seis, ocho y 10. En la capa ocho, las microvesículas y los exosomas fueron preconcentrados por un factor de 5,58, pero no se observó ninguna preconcentración notable en las otras capas. Para garantizar la reproducibilidad de este procedimiento, siguió con precisión el protocolo para el tiempo y la temperatura de incubación del horno durante la verificación del dispositivo y el tiempo de funcionamiento del dispositivo, ya que esas son las condiciones optimizadas.
El XO Pad también se puede utilizar para separar y aislar la vesícula extracelular de muestras ricas en proteínas, como suero o plasma, mediante el uso de tampón de carbonato. Este protocolo puede proporcionar una herramienta de preparación eficiente y sencilla, con sus capacidades de pre-concentración y aislamiento necesarias para la investigación clínica, como el diagnóstico, la administración de medicamentos, la inmunoterapia y otras terapias.
