Este protocolo proporciona un método para aislar cardiomiocitos en forma de varilla de cualquier tejido cardíaco, que luego se puede utilizar para medir el estado de ploidy y nucleación de estos cardiomiocitos sin análisis manual. En comparación con otras técnicas, nuestro protocolo proporciona rendimientos celulares más consistentes y morfología celular, y a diferencia de la citometría de flujo, somos capaces de verificar visualmente la nucleación y el estado de ploideidad de los cardiomiocitos. La demostración visual de este método es importante porque la división y asociación del tejido cardíaco es más fácil de apreciar.
Comience colocando el ratón eutanizado en una posición supina, y pegando las extremidades extendidas. Usa tijeras de cabeza contundente para cortar el pecho y exponer el corazón. A continuación, cortar la aorta descendente y la vena cava inferial.
Utilice una bomba peristáltica unida a un conjunto de perfusión con una aguja de mariposa de calibre 23 para perfumar el corazón inyectando tres mililitros de solución pbS de cloruro de potasio a través del ventrículo izquierdo. Asegúrese de no perforar el tabique. A continuación, inyecte 10 mililitros de solución de 4%PFA durante 10 minutos a una velocidad de un mililitro por minuto.
Use tijeras para quitar todo el corazón. Y si lo desea, aísle una región específica. Coloque el tejido en un tubo centrífugo de 1,5 mililitros que contenga un mililitro de solución de 4%PFA.
Incubarlo en un balancín durante una hora. Coloque el corazón en un plato de petri con solución PBS. Apriétalo para deshacerte de cualquier PFA que quede en los ventrículos y lávelo en PBS.
Coloque el corazón fijo en un nuevo tubo de 1,5 mililitros que contenga solución de colagenado. Luego incuba el corazón en un balancín a 37 grados Centígrados durante la noche. Al día siguiente, coloque el corazón en un plato de Petri de 35 milímetros que contenga solución de colágeno, y disociarlo en trozos de un milímetro con fórceps o tijeras.
A continuación, utilice una pipeta de transferencia para triturar aún más el tejido disociado durante dos minutos. Si aún quedan partículas de tejido, utilice una pipeta con una punta más estrecha y continúe la trituración hasta que la mayor parte del tejido se descomprima. Coloque una malla de nylon de 200 a 600 micrómetros sobre un tubo de centrífuga de 15 milímetros.
Agregue cinco mililitros de PBS a las celdas disociadas y filtre a través de la malla de nylon. Lave la malla de nylon pasando cuatro mililitros adicionales de PBS. A continuación, centrifugar la solución filtrada a 10 a 100 veces G durante un minuto.
Deseche el sobrenadante y resuspender el pellet en 10 mililitros de PBS antes de la tinción. Después de descargar la distribución de Fiji de la imagen J, abra Fiji y haga clic en ayudar, actualizar y administrar sitios de actualización. Compruebe el grupo biomedido y los plugins IFPB.
Para descargar los plugins de dependencias, ellipse split y morpho lib J.Then haga clic en close y aplicar cambios. A continuación, descargue RStudio y ábralo. Copie el código del manuscrito de texto en la línea de comandos de RConsole y pulse Intro.
a continuación, escriba Y en respuesta a todos los mensajes para instalar todas nuestras dependencias. Para realizar la cuantificación de imágenes, abra Fiji y arrastre analyzenucleation. py en la barra de estado.
Cuando se abra la ventana de edición de scripts, haga clic en Ejecutar en la esquina inferior izquierda. Aparecerá un cuadro de diálogo que le preguntará por la ubicación del directorio de datos de salida. Seleccione la carpeta donde se almacenarán todos los datos de análisis, cifras y otros datos utilizados por el software.
En los parámetros de análisis, seleccione la ubicación de las imágenes que se van a analizar e introduzca el formato de nombre de archivo de imagen mediante expresiones regulares. Después de seleccionar la configuración deseada, haga clic en Aceptar. A medida que las imágenes de diferentes etapas de la canalización de análisis aparecen en pantalla, inspeccione para asegurarse de que el umbral y la segmentación se producen correctamente. Abra analyzemultinucleatedserver.
r en Rstudio. A continuación, en la variable denominada folder name, escriba la ruta de acceso del archivo a la carpeta de datos de salida seleccionada en el último paso sin la barra diagonal final. Haga clic en Ejecutar aplicación en la esquina superior izquierda de la ventana de edición de scripts.
Utilice los controles deslizantes para establecer umbrales para el umbral de intensidad media nuclear mínima válida, el umbral mínimo válido de área nuclear y el diámetro mínimo máximo válido de hurones para los cardiomiocitos. Desplácese hacia abajo y haga clic en Aplicar umbrales seleccionados y, a continuación, haga clic en distribución de intensidad de trazado, lo que representará una gráfica de la distribución de intensidad del núcleo de toda la muestra, así como subgráficos independientes para cada variable de agrupación. Para tener en cuenta la variación de la muestra intra, desplácese hacia abajo y compruebe normalizar por separado por grupo y, a continuación, haga clic en calcular la distribución de ploidy y gráfica estimada.
Una vez que aparece el gráfico de muestra completo normalizado, los dos patrones de pico deben ser visibles. Utilice los controles deslizantes y seleccione los umbrales para aislar los picos diploide y tetraploide entre sí y los valores atípicos. A continuación, desplácese hacia abajo y haga clic en calcular ploidy y nucleación.
Por último, haga clic en el trazado de botones y guárdelo en la carpeta de resultados. Este método se puede utilizar para aislar cardiomiocitos uniformemente singularizados que son relativamente puros sin contaminar las células. Es fácil de implementar y proporciona rendimientos cardiomiocitos consistentes y calidad de diferentes aislamientos.
Los cardiomiocitos aislados con este protocolo se pueden teñir utilizando anticuerpos y azidas conjugadas con fluorocromo. Para mostrar el patrón característico de tinción de la línea Z de los sarcomeres, las células se tiñeron con anticuerpos que reconocían la actinina alfa. En un experimento separado, EdU se administró a ratones antes de aislar cardiomiocitos fijos.
Después del aislamiento, se detectaron los cardiomiocitos mononucleados, binucleados y trinucleados que habían sufrido la fase S. Para identificar núcleos individuales, la imagen original de ADN teñido se estableció en el umbral en función de la intensidad. Las elipses se ajustaban a las máscaras nucleares, segmentando núcleos individuales.
A continuación, los píxeles de la imagen se dividieron en territorios en función de la elipse a la que son más proximales, y los bordes de estos territorios se utilizaron para trazar líneas a través de clústeres nucleares. Se utilizó un proceso de segmentación similar para detectar cardiomiocitos. Esta estrategia de segmentación mostró que la mayoría de los cardiomiocitos de ratones recién nacidos son mononucleados.
La frecuencia de los cardiomiocitos mononucleados es mucho menor en ratones de dos semanas de edad, donde conforman alrededor del 25% de la población total de cardiomiocitos. Cuando se midió el estado de ploidy de los núcleos individuales dentro de los cardiomiocitos, se detectó una mayor frecuencia de núcleos tetraploides en ratones juveniles. Al aislar cardiomiocitos, es importante verificar que todos los grumos celulares se hayan separado de su trituración.
