Neisseria meningitidis es una de las causas más comunes de sepsis y meningitidis entre la población humana de todo el mundo, y la bacteria está restringida al huésped humano. En este protocolo experimental, describiremos el procedimiento personalizado para la inducción de meningitis meningocócica en un modelo de ratón basado en la inoculación intracisternal de bacterias. Este modelo murino reprodujo los eventos patológicos característicos de la meningitis meningocócica como una enfermedad humana grave.
Por lo tanto, representa una herramienta útil para evaluar la interacción huésped-patógeno y analizar el mecanismo patógeno responsable de esta enfermedad letal. El modelo de infección podría ser útil no sólo para evaluar la estrategia terapéutica innovadora para prevenir la replicación de bacterias directamente en el líquido cefarrestro, sino también para analizar la eficacia de la posible inmunoterapia pasiva contra patógenos humanos. La técnica requiere la fase de entrenamiento para garantizar el éxito no sólo del inóculo intracisterno, sino más bien en general la inducción de la enfermedad.
Demostrando los procedimientos serán Roberta Colicchio y Chiara Pagliuca como investigadoras, y Elena Scaglione como estudiante de doctorado, todo por mi laboratorio. Para empezar, escoge una sola colonia de un cultivo fresco de Neisseria meningitidis en placa de agar gonococal complementada con suplemento de 1%polibitox e inocula en 10 mililitros de caldo GC. Todos los procedimientos que implican el uso de meningococos deben hacerse bajo un armario de cubo de biosequisa de flujo laminar.
Cultivar las bacterias a 37 grados celsius en una incubadora de agitación orbital a 220 RPM y seguir comprobando la densidad óptica del cultivo en diferentes puntos de tiempo con un espectrofotómetro. Crecer la cultura hasta llegar a OD600 de 0,7 correspondiente a la fase exponencial temprana. Una vez obtenida esta densidad óptica, hacer existencias congeladas añadiendo un 10% de glicerol y dispensando un mililitro del cultivo en los viales de crio.
Conservar los viales a 80 grados centígrados hasta su uso. Antes de la infección, descongelar las bacterias congeladas a temperatura ambiente, luego transferir a un tubo centrífugo en centrífuga durante 15 minutos a 1500xG Retire el sobrenadante y vuelva a suspender a un mililitro de caldo GC fresco que contiene cinco miligramos por kilogramo de dextrano de hierro. Antes de comenzar el experimento, sopesar a los animales y evaluar su temperatura corporal.
Raspa al animal del cuello hacia abajo y desinfecta el abdomen con un 70% de etanol. Aproximadamente 2 horas antes de la infección, utilizando una aguja de calibre 25, inyectar hierro dextrán intraperitonealmente en el cuadrante inferior derecho del abdomen. Después de anestesiar al animal, compruebe la profundidad de la anestesia confirmando la ausencia de respuesta al dolor al pellizcar el dedo del dedo del dedo delfín.
Después de colocar el ratón en el gabinete de flujo laminar colocarlo en decúbito esternal y estirar cuidadosamente las extremidades y la columna cervical para mantener la columna vertebral en una posición recta. Para mantener una suspensión bacteriana consistente, mezcle suavemente antes de cargarla en una jeringa con una aguja de calibre ocho milímetros de 30. Desinfectar la cabeza con un 70% de etanol.
Coloque al animal en la reclinación lateral, tire de las orejas del camino y flexione el cuello moderadamente. Asegúrese de que la línea media del cuello y la cabeza estén en posición perfectamente paralela a la mesa. A continuación, toque las alas del atlas, asegurándose de que se superponen, y sentir la sangría natural en la línea media donde la aguja es más probable que entre en el agujero occipital.
Llene una jeringa con una aguja de calibre 8 milímetros 30 con la dosis bacteriana sub letal establecida de meningococos o dextrano de hierro suplementado con caldo GC como control en un volumen total de 10 microlitros. Utilice la aguja para identificar el punto de inyección y luego inyecte el contenido de la jeringa a la cisterna magna de los ratones a través de un orificio de rebaba occipital. Deseche la jeringa y la aguja de forma segura después de la inyección.
Coloque el animal en la jaula debajo de un armario de flujo laminar. Esperar el despertar y la recuperación completa del movimiento y proceder a la supervivencia animal de los animales infectados, como se describe en el protocolo. Después de anestesiar al ratón, desinfecte el pecho con un 70% de etanol.
Usando una aguja de calibre 25 retire 600 a 700 microlitros de sangre por punción cardíaca de la cavidad torácica. Recoger la sangre en un tubo que contenga 3,8% de citrato de sodio y almacenar a 80 grados Celsius para la posterior evaluación viable de recuentos de células bacterianas. Coloque el ratón eutanizado en la posición supina.
El uso de tijeras y fórceps cortar el pelaje a lo largo del plano sagital del cuerpo. Con alfileres, fija la piel con el pelaje en los lados del cuerpo. Utilice tijeras afiladas para cortar la membrana peritoneal.
Luego con tijeras y fórceps desechables, extirpa los órganos, como el bazo y el hígado, y poner cada uno en un plato separado de Petri esterilizado con un mililitro de caldo GC complementado con 10%glicerol. Usando un émbolo de una jeringa de cinco milímetros, homogeneice los órganos mecánicamente a temperatura ambiente durante unos dos o tres minutos hasta que se forme la suspensión de una sola célula y transfiérelo a un vial criolla. Coloque el tubo inmediatamente sobre el hielo seco.
Haga placas de agar GC con antibióticos y séquelos antes de usarlos a 37 grados centígrados durante dos a tres horas. Preparar 10 diluciones seriales completas de las muestras en caldo GC de cada tejido homogeneizado. Pídalas en placas de agar GC e incubar durante la noche a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono.
Con 70% de etanol, desinfecta la cabeza de un ratón eutanasiado. Usando pequeñas tijeras quirúrgicas y fórceps de acero de punta fina, resecar el pelaje y la piel de la cabeza removida, luego proceder hacia la parte superior del cráneo con el fin de ver claramente las suturas y guiar la apertura del cráneo. Para abrir el cráneo, inserte la punta de tijeras diminutas a través del foramen magnum.
Cortar hacia el centro del cráneo y a través de la línea media del hueso parietal al lado opuesto del cráneo y cortar suavemente a lo largo de la extremidad lateral de la sutura lambdoide. Usando fórceps de punta fina, comenzando desde la esquina posterior del parietal, levante el cráneo y tire diagonalmente hacia arriba para descubrir el cerebro, asegurándose de que el tejido cerebral no esté unido a ningún hueso de la cabeza cuando se levanta el cráneo. Utilice fórceps desechables para eliminar cualquier tejido conectivo entre el cráneo y el cerebro y no permita que el tejido cerebral se seque.
Utilice fórceps desechables para colocar inmediatamente el cerebro en un plato de Petri con un mililitro de caldo GC complementado con 10% de glicerol. Utilice el émbolo de una jeringa de cinco mililitros para homogeneizar el cerebro mecánicamente a temperatura ambiente durante unos dos o tres minutos hasta que se forme una suspensión de una sola célula. Transfiera la suspensión a un tubo estéril de 2 mililitros y guárdelo a 80 grados Celsius para la posterior evaluación viable de los recuentos de células bacterianas.
Se evaluó la supervivencia de ratones infectados con cepas Neisseria meningitidis de tipo salvaje o cssA defectuosas. La mediana de la dosis letal para la cepa de tipo salvaje correspondió al desafío meningocócico de 10 a la 4a UFC. Mientras que la tasa de mortalidad 10 a la 5a CFU fue igual a 83.4% y 100%con 10 a la 5a dosis de CFU.
Con el fin de obtener la mediana de la dosis letal para la cepa mutante defectuosa cssA, una dosis de 10 a la 8a UFC fue necesaria y la cantidad 1000 veces más alta que la cepa de tipo salvaje. Después de la inyección, hubo un rápido aumento de bacterias de tipo salvaje en el tejido cerebral alcanzando el pico en alrededor de 24 horas después de la infección. En el cerebro de ratones infectados con la cepa mutante, los recuentos viables disminuyeron progresivamente con el tiempo.
Además, el 33,3% de los ratones infectados mutantes mostraron aclaramiento bacteriano desde el lugar de la infección, a diferencia de los animales infectados de tipo salvaje. 48 horas después de la infección, el mutante defectuoso cssA fue completamente despejado en bazo e hígado, mientras que los animales infectados con la cepa de tipo salvaje exhibieron una infección persistente. El método experimental descrito podría ser útil para analizar el daño cerebral asociado con esta enfermedad letal, mediante su evaluación patológica, como inmunohistoquímica, inmunofluorescencia y análisis de sangrado cerebral.
