Este protocolo se utiliza para mapear y discriminar las transcripciones primarias y procesadas en las mitocondrias de maíz. Esta técnica incluye un paso de normalización del ARN y minimiza la influencia de cinco trifosfatos primos inestables que dificultan una clara discriminación entre las transcripciones primarias y las procesadas. Además de las mitocondrias de maíz, este método podría aplicarse a los plastoides y otras mitocondrias vegetales.
Comience por recoger 20 gramos de granos en desarrollo en un tubo de 50 mililitros sobre hielo. Transfiera los granos a un mortero preenfriado y agregue de 10 a 20 mililitros de tampón de extracción de frío helado. Moler los granos completamente, añadir más tampón de extracción y filtrar el tejido del suelo a través de dos capas de tela de filtro.
Centrifugar el filtrado a 8.000 veces G durante 10 minutos. A continuación, transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo y deseche el filtrado. Centrifugar el tubo a 20.000 veces G durante 10 minutos.
Vierta el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en seis mililitros de tampón de lavado. Aliquot la suspensión en cinco tubos libres de RNase de 1,5 mililitros y centrifugarlos a 14.000 veces G durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y congele el pellet mitocondrial en nitrógeno líquido.
Extraiga el ARN mitocondrial utilizando reactivos comerciales de acuerdo con las instrucciones del fabricante y configure un ARN cinco tratamientos de polifosfatasa de primera calidad. A continuación, recupere el ARN con un kit de purificación de ARN. El reactivo utilizado para la extracción de ARN es peligroso.
Trabaje siempre con ella en una campana de humo y siempre use bata de laboratorio y guantes. Preparar dos reacciones de circularización utilizando las mismas cantidades de ARN mitocondrial tratado y no tratado de primera calidad. Incubar ambas reacciones a 16 grados centígrados durante 12 a 16 horas y luego recuperar el ARN auto-ligado con un kit de purificación de ARN previamente utilizado.
Comience preparando una mezcla de imprimación con una proporción igual de 26 SCRT y hasta siete otras imprimaciones de transcripción inversa. Montar dos sistemas de reacción de transcripción inversa de acuerdo con las instrucciones del manuscrito e incubarlos a 42 grados centígrados durante 50 minutos. Para normalizar el ADNc, prepare dos reacciones de PCR con el mismo volumen de ADNc de los cinco ARN tratados o no tratados con polifosfatasa de primera calidad y ejecute la reacción en las condiciones de termociclismo descritas en el manuscrito.
La normalización por RRNA madura 26S es un paso clave para discriminar entre las transcripciones primarias y procesadas. Compare la abundancia de los dos productos de PCR y, si es necesario, optimice la normalización ajustando las cantidades de la plantilla cDNA. Preparar pares de reacciones PCR con volúmenes apropiados de ADNn y un par de imprimaciones divergentes como en la unión de cinco primos a tres de las transcripciones objetivo y realizar PCR de acuerdo con las instrucciones del manuscrito.
A continuación, utilice un kit de recuperación de ADN de gel para aislar las bandas prominentes que se amplifican por PCR anidado. Clonar los productos de PCR purificados en gel en un vector utilizando técnicas estándar y realizar PCR de colonia para seleccionar clones positivos que contienen las inserciones de destino. Secuenciar los productos de PCR y alinear los datos de secuenciación con el genoma mitocondrial de maíz utilizando la herramienta básica de búsqueda de alineación local o BLAST.
Elija el maíz del organismo y busque la colección de nucleótidos de la base de datos. Encuentra el cruce de cinco a tres primos de la transcripción circularizada y determina las posiciones de los cinco primos y tres termini de transcripción primo. Amplificar el fragmento de ADN utilizado para preparar la sonda de ARN y clonarlo al vector utilizado anteriormente que contiene un promotor T7, 17 pares base aguas arriba del sitio de inserción.
Etiquete las sondas de ARN con dig-11-UTP y realice la hibridación de ARN utilizando kits comerciales. Discriminar los cinco extremos primarios y procesados comparando los productos RT-PCR circulares obtenidos de los cinco ARN primarios y no tratados normalizados. A continuación, diseñe imprimaciones RT-PCR cuantitativas basadas en los resultados de la asignación y verifique los resultados de la discriminación con RT-PCR.
El gen COX-2 se utilizó como ejemplo para demostrar el mapeo y la discriminación de las transcripciones mitocondriales de maíz con la estrategia circular basada en RT-PCR. Los cDNA normalizados se utilizaron como plantillas para PCR, lo que dio lugar a dos bandas prominentes amplificadas a partir de la muestra tratada con polifosfatasa de primera. Las dos bandas fueron nombradas COX-2 una y dos recuperadas del gel y clonadas en vectores.
Los resultados de colony PCR mostraron que los clones positivos contienen inserciones con tamaño variable, lo que implica que los termini tienen cinco primos heterogéneos o tres termini primo. Los resultados de la secuenciación mostraron que COX-2 uno y dos tienen los mismos tres extremos primos en 39 nucleótidos aguas abajo del codón de parada, mientras que sus cinco termini primos se encuentran en 992 a 1, 030 y 1, 276 a 1, 283 nucleótidos aguas arriba del codón de inicio, respectivamente. Se realizó la hibridación de manchas de gel de ARN para verificar los resultados circulares de la cartografía RT-PCR y se detectaron dos bandas principales con tamaños similares a COX-2 uno y dos.
Otro par de imprimadores divergentes fueron diseñados para amplificar el COX-2 tres y cuatro bandas detectadas con la mancha de gel de ARN, pero no con la primera vez circular RT-PCR. Los resultados cuantitativos de RT-PCR confirmaron que COX-2 uno, dos, tres y cuatro eran sensibles a cinco polifosfatasas de primera calidad y que tenían cinco termini primarios. El análisis de extensión de primer se podría realizar para verificar los cinco resultados de mapeo primo aunque no está incluido en este protocolo.
