Anteriormente hemos diseñado un dispositivo para aplicar tensión mecánica a las células adherentes. En el trabajo actual, hemos rediseñado la geometría del sustrato y personalizado la configuración para imágenes de alta resolución de estas células de tensión. La principal ventaja de este sistema de estiramiento celular es que proporciona una imagen subcelular de alta resolución a 100 veces de las células de tensión.
Demostrando la fabricación del sustrato estará Vicki, una asistente de investigación de mi laboratorio. Comience diseñando un molde de polidimetilsiloxano de un solo pocillo siguiendo el protocolo de texto que lo acompaña. A continuación, mezclar 20 partes de una base de polidimetilsiloxano con una parte de agente de curado en una taza desechable.
Una vez mezclado, coloque la mezcla de polidimetilsiloxano en un desgaste de vacío a 0,8 bar durante 30 minutos para eliminar las burbujas de la mezcla. Luego, vierta la mezcla de polidimetilsiloxano en el molde y el plato. Retire cualquier burbuja adicional en esta etapa desgasificándola de nuevo a 0,8 bar de vacío durante 30 minutos.
Cuando se complete la desgasitación, hornee las muestras a 80 grados centígrados en una mesa de nivelación durante dos horas. A continuación, retire cuidadosamente las muestras del horno y déjelas enfriar a temperatura ambiente. Corta los bordes con una cuchilla y pela suavemente el polidimetilsiloxano curado.
En el polidimetilsiloxano de 150 milímetros de diámetro, dibuje una rejilla de dos centímetros por dos centímetros con un marcador. Dentro de cada cuadrado, dibuja un centímetro por un centímetro cuadrado, dejando un margen de 0,5 centímetros en todos los lados. Utilice una cuchilla para cortar cuidadosamente a lo largo de las líneas y obtener compartimentos cuadrados.
A continuación, limpie las muestras incubando en 100% acetona durante cuatro horas, 100%etanol durante cuatro horas adicionales y luego en agua autoclavada durante cuatro horas. Coloque las muestras limpiadas en papel de respaldo de película de parafina dentro de un plato de plástico de 150 milímetros de diámetro y seque la muestra en un horno celsius de 80 grados durante cuatro horas. Cuando haya terminado, selle los platos con película de parafina y guárdelos en una sala fría hasta su uso posterior.
Preparar células progenitoras y suspenderlas en medio de proliferación. Siembra estas células a una densidad de 35.000 células por centímetro cuadrado sobre superficies de plástico recubiertas de PDL. Ajuste el volumen del medio de proliferación a tres mililitros por cada diez centímetros cuadrados de superficie.
Un menor volumen de medios puede provocar aglomeraciones celulares, derivadas de las fuerzas de tensión superficial, mientras que un mayor volumen de medios en los platos puede hacer que los medios se derramen. Al tercer día después de la siembra, cosecha las células y cuentalas usando un hemocicómetro. Luego, semilla 35.000 células por placa de polidimetilsiloxano con 700 microlitros de medio de proliferación.
A continuación, agregue una construcción plasmica para etiquetar los complejos de histona H2B de la célula con proteína fluorescente verde siguiendo las instrucciones del fabricante. Después de 24 horas, monte las muestras de polidimetilsiloxano con células para estirar en el dispositivo de tensión uniaxial. A continuación, cambie el medio de todas las muestras a un medio de diferenciación.
Mida la longitud del compartimiento celular sin restricciones y gire el tornillo micrómetro de etapa para aumentar la longitud del compartimiento celular en la cantidad deseada de tensión. Deje las muestras de polidimetilsiloxano estiradas y sin estirar en la incubadora a 37 grados centígrados hasta que se tome por imágenes. Prepare la incubadora de microscopios para imágenes en vivo estableciendo la temperatura de la incubadora en 37 grados centígrados.
A continuación, lleve un objetivo de inmersión de aceite 100x a la posición central, ya que el giro objetivo no será accesible más adelante. Una vez en posición, desenrosque el objetivo y atornillarlo de nuevo con un anillo objetivo, para que el objetivo se pueda acercar a las células. A continuación, agregue una gota de aceite al objetivo.
Con un soporte impreso a medida, cubra el soporte con grasa al vacío en la periferia de la ventana y coloque un cubreobjetos de vidrio número cero de espesor en la superficie superior del soporte. Pegue la ventana de plástico en la etapa del microscopio. A continuación, atornille una etapa de traducción Z a la etapa del microscopio y muévala a la posición Z superior.
Retire 500 microlitros del medio de la placa de polidimetilsiloxano estirada que se va a tomar la imagen, y agregue este medio en el cubreobjetos de vidrio en la ventana de plástico blanco. A continuación, utilice un par de pinzas estériles para separar cuidadosamente el compartimento cuadrado de la placa de polidimetilsiloxano. Sostenga el dispositivo de tensión en posición vertical para que las células estén mirando hacia arriba, por encima de la ventana de plástico blanco e invierta cuidadosamente el dispositivo de tensión, con el fin de dejar caer cualquier medio adicional directamente en el medio del cubreobjetos de vidrio con las celdas hacia abajo.
Coloque la parte inferior del dispositivo de deformación unitaria en la etapa de traslación Z utilizando cinta adhesiva de doble cara para mantenerlo en su lugar. Mientras mira a través del ocular bajo campo brillante, muy lentamente traer el dispositivo de tensión hacia abajo y mover el objetivo hacia arriba para centrarse en las células. Realice este paso de enfoque lentamente, alternando entre la reducción de la etapa de traducción Z y la elevación del objetivo.
Si la etapa de traducción Z disminuye demasiado, las células podrían comprimirse y, por lo tanto, morir. Si elevamos el objetivo demasiado alto, podría romper el cubreobjetos de vidrio y hacer que el medio se filtre. Escanee la placa de polidimetilsiloxano en direcciones X e Y para encontrar una célula que tenga un núcleo fluorescente, utilizando la epiflorescencia a 488 nanómetros de excitación.
Asegúrese también de que la celda tiene una morfología adecuada al mirar la muestra en campo brillante. Grabe imágenes de campo ancho o de agujero abierto del núcleo con 488 nanómetros de excitación de longitud de onda y de la célula con excitación de campo brillante a intervalos de 30 segundos por fotograma durante una duración total de al menos 30 minutos. La geometría rediseñada del sustrato de polidimetilsiloxano y la configuración de imágenes que se muestra en este vídeo minimizan la distancia entre las células y el objetivo.
Esto permite la toma de imágenes de lapso de tiempo de núcleos celulares con etiqueta fluorescente utilizando un objetivo de inmersión de aceite de 100x. Para medir las fluctuaciones nucleares, primero traza la zona nuclear frente al tiempo. A continuación, detrend los datos mediante un polinomio de tercer orden.
Y finalmente, trazar las fluctuaciones residuales y calcular la desviación estándar de las fluctuaciones residuales. Las fluctuaciones nucleares de las células progenitoras de oligodendrocitos, tras la inducción química de la diferenciación con y sin una tensión de 10% de tracción, muestran que solo con la inducción química, la amplitud de las fluctuaciones nucleares mostró una disminución significativa a las 48 horas, pero no a las 24 horas. Por otro lado, la inducción química junto con una cepa de 10% de tracción mostró una disminución significativa a las 24 horas, que se mantuvo constante sin una mayor reducción a las 48 horas.
Lo más importante a recordar es que la distancia de trabajo del objetivo elegido debe ser igual o mayor que la profundidad del compartimiento de celda más el grosor del cubreobjetos. El sustrato se puede rediseñar para incorporar una cuadrícula, lo que facilitaría la toma de imágenes de la misma célula antes y después de la aplicación de la tensión, ya que un tipo de conjunto de datos antes y después reduce el ruido procedente de un error experimental. Usando esta configuración de imágenes, muchos fenómenos subcelulares dentro de las células vivas adherentes, como la localización de proteínas o la dinámica de los componentes celulares, se pueden tomar imágenes en cuestión de segundos después de aplicar la tensión mecánica.
