Este protocolo describe la preparación y el análisis de un biosensor único que ha sido diseñado para detectar los componentes químicos de los residuos de disparos. El uso de biosensores para aplicaciones forenses es único. Representa una alternativa de bajo costo y fácil de usar a la instrumentación altamente especializada que se utiliza normalmente en laboratorios forenses.
Los métodos de biología sintética descritos se pueden utilizar para cualquier sistema que utilice piezas de biología sintética estándar. El análisis químico descrito es aplicable a cualquier biosensor que exprese proteína fluorescente roja. Demostrando el procedimiento serán Andrea Soles y Elle Richardson, estudiantes de pregrado en la Universidad de Longwood.
Para comenzar este procedimiento, añada diez microlitros del ADN plásmido J10060 previamente aislado a un tubo de microcentrífuga. Agregue ocho microlitros de agua y un microlitro de cada una de las enzimas EcoRI y NHEL premezcladas con un microlitro de tampón. Para el ADN promotor, agregue diez microlitros de secuencias de ADN promotor recocido a un tubo de microcentrífuga fresco.
Agregue ocho microlitros de agua y un microlitro de cada una de las enzimas EcoRI y NHEL premezcladas con un microlitro de tampón. Con una pipeta ajustada a diez microlitros, pipetee suavemente las muestras hacia arriba y hacia abajo para mezclar. Incubar las muestras a 37 grados centígrados durante 30 minutos.
Luego, calienta y activa las enzimas a 80 grados Celsius durante cinco minutos. Almacene el ADN digerido en un congelador hasta que esté listo para proceder. En primer lugar, utilice el plasmamido y el ADN promotor que se digierieron previamente para establecer la reacción en un tubo de microcetrifuje sobre hielo, como se describe en la tabla uno del protocolo de texto.
Asegurándose de añadir el T4 DNA Ligase último. Pipetear hacia arriba y hacia abajo suavemente para mezclar la reacción, y centrifugar brevemente. Incubar a temperatura ambiente durante diez minutos.
Luego, calienta y activa a 65 grados centígrados durante diez minutos. Realice la transformación tal como se describe en el protocolo de texto. En primer lugar, configure las mezclas de reacción para PCR como se describe en la tabla dos del protocolo de texto.
Pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para mezclar las reacciones. Usando una punta de pipeta amarilla, raspa una colonia de la E.coli transformada. Transfiera un golpe de este E.coli a una nueva placa de agar de lb-ampicilina que haya sido seccionada, y luego inserte la punta de la pipeta en el tubo PCR.
Agitar la punta de la pipeta para mezclar el E. coli con la mezcla de PCR. Repita este proceso tres veces más para colonias adicionales. A continuación, cargue los tubos de PCR en una máquina PCR y comience a termociclismo como se describe en la tabla tres del protocolo de texto.
Para comenzar, etiquete el número adecuado de tubos de cultivo estériles como se describe en la tabla cuatro del protocolo de texto. Añadir dos mililitros del caldo de cultivo preparado a cada tubo. Agregue la solución de material de anilito a los tubos como se describe en la tabla cuatro.
A continuación, coloque las tapas de presión en los tubos de cultivo para que estén sueltas para permitir el flujo de aire en el tubo. Vórtice cada tubo de cultivo. Después de esto, coloque los tubos en una incubadora de temblores a 37 grados centígrados y a 220 RPM durante al menos 24 horas.
En primer lugar, utilice una toallita a base de etanol diseñada para eliminar el plomo para limpiar todas las superficies de las manos, incluso entre los dedos. Guarde las toallitas en una bolsa sellable debidamente etiquetada hasta su análisis. Use una toallita a base de alcohol para limpiar las superficies grandes que se van a probar.
Use un intercambio de algodón humedecido con etanol para limpiar las superficies pequeñas que se van a probar. Usando guantes limpios y usando tijeras que hayan sido limpiadas con alcohol, corte una sección que esté aproximadamente a un centímetro cuadrado del centro de la toallita. A continuación, coloque la pieza cortada de toallitas, o hisopo de algodón, directamente en un tubo de cultivo que contenga dos mililitros de las bacterias del sensor, y asegúrese de que esté completamente sumergido en el caldo.
Prepare el espectrómetro para recoger la presentación de fluorescentes en la longitud de onda adecuada para la variante RFP, con una longitud de onda de excitación de 500 nanómetros. A continuación, utilice un mezclador de vórtice para agitar los tubos. Transfiera cuidadosamente cada sobrenadante a una cubeta de bajo volumen y recoja la intensidad de emisión.
Con un mezclador de vórtices, agite los tubos. Transfiera 200 microlitros del caldo a un pozo en el plato del pozo. Registre qué muestras entraron en cada pozo de este plato.
Configure el harineilómetro para recoger la intensidad de emisión en la longitud de onda adecuada para la variante RFP. Los espectros de fluorescencia para una variante RFP representativa muestran tanto el control negativo como los espectros en dos niveles diferentes de anilito añadido. La señal fluorescente máxima para la variante RFP utilizada en este trabajo se observa en 575 nanómetros.
Se recopilan datos representativos para el mismo conjunto de soluciones, tanto del espectrómetro portátil como del fluorómetro. Hay una tendencia general de la fluorescencia aumentando a medida que aumenta la concentración de anilito. Vale la pena señalar que a altas concentraciones, más de 800 partes por mil millones para el sensor de plomo, la respuesta cae debido a la toxicidad del plomo a una concentración tan alta.
El análisis de muestras de hisopo de etanol desde el interior de una carcasa de cartucho de calibre 40 gastado proporciona pruebas de los resultados principales. Los resultados positivos de cada una de las tres bacterias del sensor, indican una prueba positiva de residuos de disparos. Los biosensores preparados en este protocolo también se pueden utilizar individualmente para detectar contaminación en alimentos, agua o muestras ambientales.
Esta técnica allana el camino para que los investigadores desarrollen biosensores utilizando técnicas de biología sintética estándar para una variedad de diferentes anilitos químicos. Se debe usar equipo de protección personal, y los analistas deben lavarse las manos y desinfectar las superficies después de manipular E.coli. Los desechos deben ser autoclavados, y cualquier residuo que contenga metales pesados debe tratarse en consecuencia.
