Electroforesis de DNA utilizando naranja de tiazol en lugar de bromuro de etidio o tintes alternativos

Este protocolo es una alternativa fácil y económica al uso de bromuro de etidio para la detección de ADN durante la electroforesis. Mediante la eliminación del bromuro de etidio, se puede utilizar luz UV o luz azul para la detección. La luz azul no es perjudicial para el ADN, lo que mejora la posibilidad de éxito para experimentos posteriores.

Es muy fácil probar esto. Sólo tienes que reemplazar el bromuro de etidio en tus geles por naranja tiazole. Para empezar, preparar 1%mini-gels mezclando aproximadamente 0,7 gramos de agarosa en 70 mililitros de tris-acetato-EDTA o tampones de tris-borato.

A continuación, disuelva la naranja tiazole en DMSO para hacer una solución de 10.000X. Aunque no es particularmente sensible a la luz, almacene el tiazole naranja en la oscuridad cuando no esté en uso. Para el almacenamiento a largo plazo, haga alícuotas de la mezcla de tiazole naranja-DMSO y congénalas.

A continuación, añadir tiazole naranja a una concentración final de 1,3 microgramos por mililitro, y microondas la mezcla de tampón de agarosa y naranja tiazole para disolver la agarosa durante aproximadamente 60 segundos. Vierta la mezcla de agarosa en un aparato de fundición de gel que contenga un peine adecuado, y permita que la solución de agarosa se solidifique en un gel. Para cargar el gel, primero coloque el gel en el aparato de electroforesis, si no está ya presente.

A continuación, agregue el tampón de funcionamiento TAE o TBE para cubrir la superficie del gel. A continuación, con un tinte de carga, cargue 10 microlitros de una muestra de ADN. Incluya una escalera de tamaño de ADN como referencia.

Coloque la cubierta y los electrodos, y ejecute el minigel a 100 voltios hasta que el tinte de carga viaje aproximadamente de cuatro a siete centímetros para un mini-gel. Si no se aplicó tiazole naranja antes de la fundición del gel, manche el gel sumergiéndolo en el tampón que contiene tiazole naranja con agitación suave durante unos 20 minutos o hasta que las bandas se detecten completamente. Para visualizar el gel con un transilluminador UV, retire el gel del aparato de electroforesis y colóquelo en el transilluminador UV.

Para visualizar el gel utilizando un transilluminador de luz azul o una linterna, coloque el gel en el transilluminador de luz azul o dirija la linterna LED azul al gel desde arriba o abajo. Utilice un filtro de emisión de ámbar para filtrar la luz azul, permitiendo la visualización de la fluorescencia de los complejos de naranja tiazole de ADN y para proteger los tintes. Para una mayor digestión o ligadura, corte las bandas de ADN deseadas del gel y proceda a extraer ADN utilizando un kit o protocolo fácilmente disponible.

Seleccione los ajustes de excitación y emisión adecuados en el aparato de imagen de gel. En ausencia de un sistema de imágenes con filtros apropiados, coloque un filtro ámbar entre la cámara y la fuente de excitación de luz azul de gel. Los límites de detección son similares entre el bromuro de etidio, el tiazole naranja y un tinte de ADN comercial común detectable con luz azul, con el límite de detección de los tres tintes de uno a dos nanogramos por carril en un minigel.

El gel de agarosa teñido de naranja tiazole de un resumen de restricción es detectable cuando se excita con un UV o un transilluminador de luz azul o con una linterna de luz azul. Mientras que el tiazole naranja parece ser menos peligroso que el bromuro de etidio, todavía se debe usar un equipo de protección personal estándar, como guantes y gafas.