Este protocolo nos ayuda a determinar cómo las alteraciones en la biomecánica local, la arquitectura tisular, los entornos paracrinos y las interacciones juxtacrinas influyen en el fenotipo celular. Esta técnica nos permite explorar paradigmas clásicos y embriología experimental sin causar los insultos tisulares a gran escala que normalmente surgen en los experimentos gráficos tradicionales. Para encontrar la presión adecuada para la inyección, es útil comenzar con una presión de inyección más baja y aumentar incrementalmente hasta que se logra un flujo constante de células.
Visualizar esta técnica ayuda a lograr una comprensión directa de cómo el equipo de inyección debe posicionarse en relación con el tejido objetivo. Demostrar el procedimiento serán dos miembros de mi laboratorio, Trevor Henley y Kandace Thomas. 24 horas antes de la implantación, tire de los capilares de vidrio en un tirador de micropipetas de acuerdo con los protocolos estándar y sumerja los capilares en agente siliconizador para recubrir las superficies externas de las agujas.
A continuación, cargue de 5 a 10 microlitros de agente siliconizador en una punta de pipeta de microinyección y coloque la punta en el extremo ancho de un capilar de vidrio tirado recubierto externamente. Coloque la punta de la pipeta lo más cerca posible de la punta de la aguja de vidrio y expulse el agente de silicio mientras retrae lentamente la pipeta de carga para minimizar las burbujas de aire dentro de la aguja. Deje el agente de silicona en la aguja de vidrio durante 10 minutos antes de utilizar una nueva pipeta de carga para aspirar la solución.
A continuación, seque las agujas en una campana de humo durante la noche. Para la preparación del embrión anfitrión, incubar huevos de pollo fértiles en una orientación horizontal en una incubadora humidificada a 38 grados Centígrados y utilizar fórceps en ángulo para hacer una punción de más de un milímetro de diámetro en la parte inferior del extremo plano de cada huevo a lo largo del ecuador de huevo. Inserte una aguja de calibre 18 unida a una jeringa de 10 mililitros en la punción para extraer unos cinco mililitros de albúminas.
Y aplicar cinta transparente en la parte superior de la cáscara de huevo. Anota la región grabada a lo largo de la parte superior del huevo con fórceps en ángulo y usa tijeras de tenotomía curvas para cortar una ventana de aproximadamente 2,5 centímetros en la sección grabada del huevo. Inspeccione y escenifique el embrión basándose en los criterios establecidos por Hamburguesa y Hamilton y utilice una jeringa de un milímetro equipada con una aguja de calibre 32 para inyectar alrededor de 200 microlitros de una dilución de uno a cinco de tinta india en HBSS debajo del embrión.
A continuación, selle la punción con cinta transparente y añada un mililitro de HBSS en el disco embrionario antes de sellar la cáscara con ventanas con película de parafina para colocar el huevo de nuevo en la incubadora humidificada. Cuando los embriones lleguen a Hamburger y Hamilton etapa 19, enjuague los capilares de vidrio recubiertos de silicona con agua desionizada y deje que los capilares se sequen durante tres a cuatro horas a temperatura ambiente. Mientras tanto, transfiera un embrión de un huevo a un plato Petri de 100 por 15 milímetros que contenga la temperatura ambiente estéril HBSS y coloque el plato bajo un microscopio estéreo.
Usando fórceps, tijeras de tenotomía y una micro espátula, aísle todo el corazón embrionario del embrión y aísle las aurículas del corazón. Coloque el tejido auricular en un tubo estéril de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contenga un mililitro de HBSS sobre hielo. Cuando se haya recogido todo el tejido del donante, pele el tejido por centrifugación en una microcentrífuga en ángulo fijo.
Para la digestión del tejido del donante, vuelva a suspender los gránulos en un mililitro de EDTA precalentado 05%para una incubación de 15 minutos en un bloque de calor de agitación a 300 rotaciones por minuto. Al final de la incubación, pipetear la solución de digestión varias veces para romper cualquier tejido restante y peletizar el color cardíaco por centrifugación. Re-suspenda el pellet en un mililitro de solución neutralizante de trippsina para otra centrifugación seguida de re-suspensión en 400 microlitros de solución de colorante fluorescente rojo.
Después de 20 minutos a 37 grados Celsius, peletiza las células por centrifugación durante uno a tres lavados en un mililitro de HBSS por lavado. Luego vuelva a suspender las células etiquetadas a cinco veces diez a las cuartas células por concentración de microlitros en HBSS fresco. Para la inyección in vivo de las células donantes, vuelva a cargar la suspensión celular en una pipeta capilar de vidrio seca tratada con silicona, como se ha demostrado, y monte la pipeta en el aparato microinyector de presión.
Transfiera cada embrión huésped para ser inyectado desde la incubadora humidificada a un soporte de óvulo bajo un microscopio fluorescente de disección estéreo. Y utilice fórceps finos estériles para abrir la membrana vitellina. Haga una incisión de 5 a un milímetro en el pericardio y coloque el microinjecter de manera que la punta de la aguja de microinyección penetre en el tejido objetivo.
Ajuste el microinyector para aplicar pulsos únicos de 5 segundos de duración y que van de 100 a 400 hectopascals en presión. Y inyectar a presión las células. Es fundamental verificar una implantación celular exitosa mediante la toma de imágenes de la señal fluorescente antes de volver a sellar el óvulo.
El embrión también puede ser fotografiado para documentar este procedimiento. Cuando se hayan inyectado todas las células, retraiga el aparato microinyector y retire el óvulo del soporte. A continuación, agregue un mililitro de HBSS caliente en el embrión.
Selle el huevo con cinta adhesiva transparente y devuelva el huevo a la incubadora humidificada durante 24 horas después de la implantación. Aquí, se muestra el corazón y el tejido circundante de un corazón embrionario huésped después de la implantación del miocito auricular del donante. En este experimento representativo, las células donantes se inyectaron microinyecía en el proepicardium de un embrión huésped de una etapa similar.
La sección óptica mediante un microscopio confocal reveló que las únicas células positivas del marcador muscular cardíaco dentro del proepicardium eran las células positivas rojas fluorescentes implantadas focalmente. Tenga cuidado de no manipular en exceso el embrión receptor, ya que las rupturas en el corazón y la vasculatura local causada por la aguja de inyección pueden resultar en una menor viabilidad. Después de este procedimiento, se pueden realizar una variedad de ensayos posteriores, incluyendo inmunohistoquímica, hibridación in situ y clasificación celular.
El agente siliconizador es extremadamente inflamable y agudamente tóxico. Siempre debe ser manejado con cuidado y equipo de protección personal adecuado dentro de una campana de humos.
