La obtención de cantidades suficientes de proteínas de membrana para aplicaciones posteriores sigue siendo un desafío técnico importante. Este protocolo permite la purificación de varias proteínas de transporte de membrana a la homogeneidad. Una ventaja clave de esta técnica es que Saccharomyces cerevisiae es un sistema de expresión eucariota rentable y de tiempo para proteínas de membrana que permite la optimización de muchas variables experimentales clave.
Comience por inocular tres colonias de levadura transformadas, en 50 mililitros de medio selectivo suplementario completo sin histidina. Suplementado con base de nitrógeno de levadura y 2%glucosa para una incubación durante la noche a 190 rotaciones por minuto y 30 grados Celsius. Quite el cultivo al día siguiente.
Utilice un espectrofotómetro para determinar la densidad óptica a 600 nanómetros o OD 600. E inocular cada uno de cuatro matraz de dos litros que contiene 500 mililitros de medio de cultivo a un OD 600 de 0.01. Luego agitar los cultivos a 190 rotaciones por minuto a 30 grados Celsius durante 30 horas para permitir que las células consuman toda la glucosa y crezcan a una alta densidad.
Para inducir la expresión del transportador de borato, agregue 125 mililitros de cinco x medio de peptona de levadura, complementado con 10%gata a 190 rotaciones por minuto a 30 grados centígrados durante 16 horas. Luego cosecha las células de levadura por centrifugación y resuspend el pellet en 100 mililitros de agua fría. Gire en vórtice para resuspender el pellet de levadura y transferir en serie la solución para hacer esto con todas las botellas que contienen pellets.
Para cosechar las membranas de levadura, primero, agregue 11,25 mililitros de un Tris molar, 0,45 mililitros de 0,5 molares EDTA y 2,25 mililitros de 100 PMSF mililares a las células resuspendidas. Agregue agua a un volumen final de 225 mililitros y transfiera las células a un bote batido de perlas de metal de 450 mililitros. Rematar el volumen restante con cuentas de vidrio frías de 0,5 milímetros y montar la cámara de cuentas con un rotor.
Sumerja la cámara en un baño de hielo y realice seis pulsos de un minuto, separados por dos minutos de descanso para evitar el sobrecalentamiento del izado. Después del último pulso, retire la membrana de filtración de un filtro de tapa de botella desechable de plástico atornillado en una botella de vidrio y vierta el contenido de la cámara de cuentas sobre el conjunto mientras aplica vacío. A continuación, enjuague con los dos x tampón de lavado de cuentas añadiendo a la cámara girando y luego añadiendo a las cuentas.
Enjuague la cámara de cuentas con 225 mililitros de tampón de lavado y lave las cuentas con el contenido de la cámara. Recoger el color por centrifugación y decantar el sobrenadante en botellas de policarbonato para ultracentrifugación para la recolección de las membranas. Al final de la ultracentrifugación deseche el sobrenadante y pese las botellas con los pellets de membrana antes de resuspender las membranas en aproximadamente 35 mililitros de tampón de resuspensión de membrana.
Añadir las suspensiones a un douncer de vidrio, a continuación, Dounce homogeneizar las membranas una alícuota del homogeneización en un tubo cónico de 50 mililitros para un almacenamiento negativo de 80 grados Centígrados. Pesar las botellas de centrífuga vacías para determinar la masa de las membranas cosechadas. Para la solubilización y purificación de proteínas, añadir una barra de agitación y 150 miligramos de DDM por gramo de membrana a un vaso de precipitados en hielo y resuspend las membranas descongeladas a un volumen final de 15 mililitros de tampón de resuspensión de membrana, complementado con un PMSF mililolar y 20 imidazoles milivolilares por gramo de membrana.
Agregue la solución de membrana al vaso de precipitados durante una hora de agitación en un baño de hielo. Seguido de centrifugación para peletizar el material no solubilizado. En una sala fría de 4 grados centígrados, filtre el sobrenadante a través de un filtro de jeringa de cinco micrómetros y utilice una bomba peristáltica ajustada a un caudal de un mililitro por minuto para cargar la muestra en una columna de afinidad de níquel inmovilizado de un mililitro Luego, lave la columna con volúmenes de 10 columnas de tampón de lavado y diluya la proteína en el tampón de elución.
Recoger el eluido en diez fracciones de un mililitro. Ejecute las fracciones de gel preparadas recogidas en un gel de página de cuatro a 20%Tris-Glycine SDS junto con el lisato solubilizado y las fracciones de lavado a temperatura ambiente, tirando del pico recogido fracciones eludidas para la concentración a un volumen de 500 micro litros o menos en un concentrador de corte de 50 kilos de dalton en una centrífuga de sobremesa a cuatro grados Celsius. Filtrar la proteína concentrada a través de un filtro de columna de espín de 0,2 micrómetros e inyectar el filtrado en una columna de exclusión de tamaño equilibrada en un tampón S-200.
Después de ejecutar las fracciones máximas en un segundo gel de página Tris-Glycine SDS de cuatro a 20%, manchar el gel y recoger las fracciones máximas puras para la concentración en un concentrador de corte Daltonoff de 50 kilos a cuatro grados Celsius como acaba de demostrar. A continuación, mida la absorbancia de la muestra de proteína a una longitud de onda de 280 nanómetros para determinar la concentración antes de almacenar la muestra indefinidamente a 80 grados Celsius negativos. Para realizar un ensayo de reticulación de glutaraldehído, primero, agregue 0,5 miligramos por mililitro de proteína descongelada en tres microlitros de Tampón S-200 a cinco microlitros de tampón S200.
Completar la reacción de control negativo con la adición de un microlitro de 20%sulfato de dodecil sódico y un microlitro de 1,5% glutaraldehído. Completar las muestras experimentales con la adición de un micro litro de agua y un micro litro de 1,5% glutaraldehído. Después de 30 minutos a temperatura ambiente terminar la reacción con cinco microlitros de 3x SDS página gel de carga die que contiene un exceso de tampón Tris para apagar el glutaraldehído y cargar todos los 15 micro litros de la solución en un cuatro a 20%Tris-Glycine SDS gel de página.
Luego, ejecute el gel a 200 voltios durante 30 minutos antes de la tinción para determinar la extensión de la reticulación de dimer como lo evidencia una banda que se ejecuta al doble del tamaño del monómero desnaturalado. Mancha el gel agitando en una coctelera orbital lenta con la mancha de gel añadida al gel. Aquí los geles típicos para las fracciones eludidas de la cromatografía de afinidad de níquel muestran tres proteínas parcialmente purificadas con las fracciones de izado que no demuestran una banda significativa correspondiente al transportador de borato como se esperaba para proteínas que no expresan bien.
El carril de lavado ad millimolar en cada gel muestra una pérdida mínima de la proteína etiquetada con tentidina a pesar de su concentración relativamente alta de emisores. Mientras que las bandas correspondientes a los transportadores de borato son evidentes en las fracciones eludadas. Antes de la inyección de columna S200, las proteínas no están suficientemente purificadas para muchas aplicaciones posteriores como se indica en las bandas adicionales de cada muestra.
Sin embargo, después de su inyección en columnas de exclusión de tamaño, se pueden observar fracciones eludidas de alta pureza. La reticulación demuestra que los transportadores homoméricos purificados podrían tener su montaje en solución fácilmente evaluado con el grado de reticulación que depende del número de residuos de lisina cerca unos de otros Es importante recordar que una vez que comienza la recolección celular, la proteína debe mantenerse fría en todo momento. Ya sea sobre hielo en una sala de cuatro grados centígrados o en un caso de delicatessen.
Después de este procedimiento, las proteínas de membrana se pueden caracterizar aún más por métodos biofísicos, bioquímicos o estructurales, incluyendo cristalografía de rayos X o microscopía crioelectrónica. Al permitir la purificación de cantidades de miligramos de proteína homogénea, estas técnicas se utilizaron para determinar la estructura cristalina de la Arabidopsis thaliana un transportador.
