Esta técnica nos permite medir la susceptibilidad a los antibióticos en condiciones clínicamente relevantes. La técnica también nos permite determinar la verdadera concentración de antibióticos que puede matar bacterias en áridos. Esta técnica se puede aplicar para determinar la concentración necesaria para eliminar los agregados GC.
El método también se puede aplicar para medir la susceptibilidad antimicrobiana de cualquier bacteria que sea capaz de formar agregados. Preste atención a los pasos de la lelisis para asegurarse de que la lelisis está completa. De lo contrario, el ensayo de medición de ATP subestimará el número de bacterias viables.
La visualización de este método permitirá a otros investigadores seguir y replicar este experimento con consistencia. Comience por rayar Neisseria gonorrhoeae, o cepas de GC, en el agar GCK complementado con 1%Kellogg para una incubación de 16 a 18 horas a 37 grados centígrados y 5% dióxido de carbono. A la mañana siguiente, utilice un microscopio de luz para seleccionar cuidadosamente colonias pili-negativas sin bordes oscuros o colonias pili-positivas con bordes oscuros de cada plato, y rayar las colonias recogidas en nuevas placas GCK para un cultivo de 16 a 18 horas a 37 grados Celsius y 5% dióxido de carbono.
A la mañana siguiente, utilice un aplicador estéril para recoger colonias de GC de cada plato y resuspender cada hisopo en caldo caliente complementado con 4.2%sodio bicarbonato y 1%Kellogg solución. Mida la densidad óptica a 650 nanómetros, o OD650, para determinar la concentración de las bacterias suspendidas y ajustar la concentración de GC a aproximadamente una por 10 a las ocho unidades formadoras de colonias por mililitro. A continuación, agregue 99 microlitros de la suspensión GC en pozos individuales de una placa de 96 pozos y permita que las bacterias se acumule a 37 grados centígrados y 5% dióxido de carbono durante seis horas.
Al final de la incubación, añadir un microlitro de ceftriaxona diluida en serie a cada pozo dejando algunos pozos sin tratar para servir como controles y devolver la placa a la incubadora durante otras 24 horas. Al día siguiente, sonicar la suspensión en cada pozo tres veces a 144 vatios y 20 kilohercios durante cinco segundos por sonicación y añadir 100 microlitros de reactivo de brillo de utilización de ATP disponible comercialmente a cada pozo. Transfiera cuidadosamente 150 microlitros de mezcla de cada pozo a pozos individuales de una nueva microplaca negra de 96 pocillos y mida la absorbancia de cada pozo a 560 nanómetros en un lector de placas.
A continuación, calcular la tasa de supervivencia por la proporción de la lectura obtenida después del tratamiento antibiótico en serie a la lectura de los pozos no tratados. Para la visualización de los agregados GC vivos/muertos, utilice un aplicador estéril para recoger GC de las placas cultivadas durante la noche y resuspender el GC en medio GCP precalificado complementado con 1%Kellogg. Mida el OD650 por espectrofotometría y ajuste la concentración a aproximadamente una vez 10 a las siete unidades formadoras de colonias por mililitro.
A continuación, añada 198 microlitros de suspensión GC en cámaras de ocho pozos de fondo de tapapso e incubar las cámaras a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante seis horas. Al final de la incubación, tratar las bacterias con dos microlitros de ceftriaxona por condición de agregación y devolver las cámaras a la incubadora para el período de incubación experimental adecuado. Al final de la incubación, añadir 0,6 microlitros de solución de tinción viva/muerta en cada pocóy que las cámaras vuelvan a la incubadora durante 20 minutos adicionales.
A continuación, utilice un microscopio confocal para obtener imágenes de la serie z. Para medir el tamaño de los agregados GC, abra la primera imagen en ImageJ y seleccione líneas a mano alzada para rodear el área de cada agregación de la imagen. Haga clic en analizar y medir.
El tamaño de los agregados se indicará en la columna de área. Para cuantificar la relación de intensidad de fluorescencia de la mancha viva a muerta en cada agregado, haga clic en analizar y establecer mediciones y compruebe la densidad integrada en la ventana emergente. Haga clic en Aceptar y haga clic en la herramienta imagen, color y canales.
Seleccione el color y el canal uno como la fluorescencia para la tinción de bacterias muertas. Seleccione líneas a mano alzada para rodear el área de cada agregación y haga clic en analizar y medir para obtener la relación de intensidad de fluorescencia para cada agregado en la columna de densidad integrada. Seleccione el canal dos para la fluorescencia para la tinción bacteriana viva y mida la intensidad de la fluorescencia en cada agregado como acaba de demostrar.
A continuación, divida los datos de intensidad de fluorescencia en vivo por los datos de intensidad de fluorescencia muertos para obtener la relación de intensidad de fluorescencia viva a muerta. En este experimento representativo, las bacterias pili positivas no agregadas, positivas o agregadas y alteradas pili positivas fueron tratadas con diluciones en serie de ceftriaxona antes de la medición de sus niveles de ATP. El GC preagregado demostró una supervivencia significativamente mayor que la GC no agregada o la agregación interrumpida cuando se trata con concentraciones iguales de ceftriaxona o superior.
Las cepas Pili-positivas que forman agregados más grandes mostraron los niveles más altos de ATP después del tratamiento con ceftriaxona en comparación con las cepas mutantes. Independientemente de la cepa probada, la tinción viva/muerta antes de que el tratamiento con antibióticos revelara bacterias muertas ubicadas en gran medida en las capas externas del cultivo, mientras que la GC viva se identificó principalmente dentro del núcleo de los agregados tratados con ceftriaxona. Como era de esperar, las bacterias pili-positivas formaron los agregados más grandes, mientras que los cultivos pili-negativos formaron los más pequeños.
En particular, los agregados pili-positivos todavía estaban vivos en sus capas principales después del tratamiento con antibióticos, mientras que GC en los pequeños agregados mutantes sueltos estaban muertos. Basado en el tamaño y la supervivencia del GC, se puede trazar un gráfico de correlación para examinar la relación entre el tamaño de agregación y la supervivencia de los antibióticos de las bacterias. La sonicación es importante para asegurarse de que el ATP de cada bacteria individual se libera dentro de los agregados estrechamente unidos.
De lo contrario, las mediciones no serán coherentes. Es importante planchar las bacterias después de que se agregan y son tratadas con antibióticos para medir tanto las bacterias viables como las capaces de replicación. La técnica mide la influencia de la agregación de bacterias en la susceptibilidad a los antibióticos permitiendo a los investigadores desarrollar mejores fármacos para el tratamiento de enfermedades.
