Este método puede responder preguntas en química de proteínas y descubrimiento de fármacos como qué condiciones estabilizan una proteína? ¿Qué mutaciones afectan la termoestabilidad de una enzima? ¿Y qué ligandos se unen a un objetivo proteico?
Las principales ventajas de esta técnica son que es rápida, se realiza fácilmente en un laboratorio estándar y se adapta perfectamente a aplicaciones de rendimiento medio a alto. Para preparar la muestra de proteína transferir 10 microlitros de cada condición de una pantalla de estabilidad en el pozo correspondiente de una placa de 96 pozos utilizando una pipeta multicanal para ahorrar tiempo. A continuación, prepare un mililitro de aproximadamente un miligramo por mililitro de solución de proteína en un sistema tampón adecuado.
Si realiza un ensayo de cambio térmico, añada el tinte de naranja SYPRO a la muestra de proteína a una concentración final de 20X. Mezclar por inversión o por un breve vórtice. Ahora transfiera 10 microlitros de la solución proteica a cada pozo de la placa de 96 pozos.
Selle y centrifuga la placa de 96 pozos durante dos minutos a 600 veces G para garantizar que la muestra de proteína y el componente de la pantalla se mezclen. Vuelva a sellar la pantalla de estabilidad y almacene la pantalla a cuatro grados centígrados durante un máximo de cuatro meses. Para realizar el experimento TSA, abra el cajón de muestra presionando firmemente la sangría en el lado derecho del cajón.
Coloque la bandeja de 96 pozos en el sistema RTPCR con bien A-uno en la parte posterior izquierda. Haga clic en el nuevo botón de experimento para comenzar a configurar un experimento de TSA. En la pestaña Propiedades del experimento, haga clic en la opción Curva de fusión cuando se le pregunte, ¿qué tipo de experimento desea configurar?
A continuación, haga clic en la otra opción cuando se le pregunte, ¿qué reactivos desea utilizar para detectar la secuencia de destino? En la ficha Configuración de placa, Definir destinos y muestras, escriba un Nombre de destino y, a continuación, establezca Reportero como ROX. Y Quencher como Ninguno.
En la ficha Configuración de placa, Asignar objetivos y muestras, defina la opción Seleccionar el tinte que se utilizará como referencia pasiva como Ninguno. En la misma pestaña, asigne cada pozo de la placa de 96 pozos al nombre de destino introducido en el paso anterior. En la pestaña Método de ejecución, elimine los pasos hasta que haya un total de tres.
Establezca el primer paso en 25 grados centígrados, con una velocidad de rampa del 100% y un tiempo de cinco segundos. Establezca el segundo paso en 95 grados centígrados, con una velocidad de rampa del 1% y un tiempo de un minuto. Finalmente, establece el tercer paso en el 95 grados Celsius con una velocidad de rampa del 100% y un tiempo de cinco segundos.
Elija Recopilar datos mediante el menú desplegable Recopilar datos o haciendo clic en el icono de recopilación de datos. Ajuste el volumen de reacción por pozo a 20 microlitros. Haga clic en el botón Iniciar ejecución para iniciar el experimento de TSA.
NanoDSF se puede utilizar para sondear la estabilidad térmica de proteínas sin el uso de tintes extrínsecos. Las muestras se pueden preparar en 96 placas de pozo como se describió anteriormente en el protocolo, pero sin añadir ningún tinte naranja SYPRO. Abra el cajón de muestras pulsando el botón Abrir cajón.
Asegúrese de que el equipo esté limpio, prestando especial atención a cualquier polvo cerca del estante de muestras. Si el sistema tiene un espejo dispersante de espalda, límpielo con etanol y un tejido libre de pelusas. Cargue los capilares con aproximadamente 10 microlitros de cada pozo de la placa de 96 pozos tocando un extremo del capilar en la solución.
Y luego coloque el capilar en los soportes capilares correspondientes del estante de muestra. Tenga cuidado de no contaminar el centro de los capilares con huellas dactilares, ya que esto podría interferir con las lecturas de fluorescencia a lo largo del experimento. Inmovilizar los capilares con una tira de sellado magnética.
Inicie un escaneo preliminar para detectar la posición y la intensidad de cada capilar pulsando el botón Iniciar análisis de descubrimiento en la pestaña Análisis de detección. Aumente o disminuya la fuerza de excitación incidente desde una potencia inicial del 10% hasta que el pico de cada exploración capilar esté entre 4.000 y 12.000 unidades. En la pestaña Escaneo de fusión, programe un Análisis de fusión estableciendo la opción Pendiente de temperatura en 7,0 grados por minuto.
Temperatura de inicio a 25 grados centígrados. Y la temperatura final a 95 grados centígrados. A continuación, inicie el experimento nanoDSF pulsando el botón Iniciar fusión.
Repita estos pasos para preparar los ejemplos para un experimento completo. Una vez configurado el experimento completo, vaya a la pestaña Escaneo de fusión y programe un Análisis de fusión estableciendo la opción Pendiente de temperatura en 1,0 grados centígrados por minuto. Temperatura de inicio a 25 grados centígrados.
Y la temperatura final a 95 grados centígrados. Por último, inicie el experimento nanoDSF pulsando el botón Iniciar fusión. T m se utiliza como una medida cuantitativa de la estabilidad térmica de proteínas en un punto de referencia para comparar la favorabilidad de diferentes condiciones.
Aquí se muestran los resultados de la muestra de la pantalla de sal, ejemplificando las propiedades de estabilización térmica del cloruro de amonio hacia la lysozyme. La comparación de los valores T m de la lysozyme con la pantalla de pH revela que el acuerdo entre TSA y nanoDSF es generalmente bueno, pero nanoDSF muestra una tendencia a identificar valores de T m ligeramente más altos en cambios T m ligeramente más grandes que TSA. Existe una tendencia general de aumento de la estabilidad con la disminución de los valores de pH.
El rango de valores T m obtenidos utilizando diferentes sistemas de búfer con valores de pH idénticos puede ser significativo. Para combinaciones de lysozyme de condiciones que producen los valores TSA T m más altos de cada pantalla de estabilidad se probaron para sondear un efecto combinado sinérgico. Hay un aumento general en los valores de T m a medida que se agregan más componentes del sistema de búfer.
Un efecto sinérgico notable puede ocurrir cuando los componentes individuales de un búfer se optimizan y se combinan con las pantallas de estabilidad. Siguiendo esta técnica se pueden utilizar otros métodos como la cristalización para determinar la estructura tridimensional de una proteína y desentrañar la base molecular para la unión de ligandos. Además, proporcionamos información sobre la estabilidad de las proteínas como parte del proyecto Virus-X, esta técnica es aplicable a una amplia gama de sistemas de descubrimiento y desarrollo de fármacos.
