Este método puede ayudar a responder a la pregunta de cómo la integración del provirus del VIH influye en la expresión génica andrógina, y por qué ciertos sitios de integración genómica están siendo seleccionados en células infectadas por el VIH últimamente. La principal ventaja de esta técnica es que se pueden producir modelos in vitro para la infección por el VIH, que transportan reporteros provirales dirigidos a sitios de integración elegidos utilizando ingeniería genómico basada en CRISPR/Cas9. Demostrando el procedimiento estarán Thomas Walther, estudiante de doctorado, y Julia Bialek, un postdoctorado de mi laboratorio.
Comience usando UCSC Genome Browser para extraer en-silico la secuencia genómica del locus genómico deseado para ser atacado. Para elegir ARN guía de 20 nucleótidos para la orientación del locus genómico elegido, utilice la herramienta web E-CRISP. A continuación, seleccione Homo Sapiens Genome Reference Consortium Human Genome:Build 38.
Genoma de referencia como el organismo y la entrada 2.000 pares base de la secuencia genómica, cubriendo el locus genómico deseado previamente extraído. Inicie una búsqueda de ARN de guía utilizando la configuración de aplicación media con cualquier PAM, cualquier cinco objetivos de base principal y fuera de destino toleran desajustes e intrones excluidos e islas CPG. De la lista con posibles diseños de ARN guía que aparece, seleccione un ARN guía con una puntuación alta para la especificidad y eficiencia, que es lo más cerca posible del locus genómico deseado para ser dirigido.
Abra el navegador NCBI Blast para hacer estallar la secuencia de ARN guía elegida contra el genoma de referencia. Para comprobar la unicidad del sitio de enlace de ARN guía seleccionado, primero seleccione humano como genoma y, a continuación, introduzca la secuencia guía-ARN como secuencia de consulta. A continuación, seleccione secuencias muy similares o Mega Blast como el programa para asegurarse de que la secuencia guía-ARN es única.
Después de eso, seleccione 1.000 pares base in-silico, aguas arriba y aguas abajo de la secuencia guía-ARN de la secuencia genómica extraída al principio. Utilice estos 1.000 pares base seleccionados, aguas arriba y aguas abajo como brazos de homología de cinco y tres primos para apuntar a la construcción vectorial y a la secuencia de reporteros adyacentes que se van a apuntar. 24 horas antes de la transfección de células T de jurkat, preparar una placa completa de 6 pocillos de las células para un solo experimento de apuntamiento.
Para empezar, placa 1, 250, 000 células en 2.5 mililitros de RPMI 1640 con suplementos y sin antibióticos, por pozo. Al día siguiente, añadir a microgramos de vector de orientación circular y dos microgramos de Cas9 y plásmido de expresión de ARN guía por pozo, a 250 microlitros de medio comercial RPMI optimizado para la transfección, en un tubo de reacción y mezclar bien por vórtice. A continuación, agregue lentamente 12 microlitros de agente de transfección al medio de ADN sin tocar la pared del tubo.
Deslice el tubo e incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente. Agregue la mezcla dropwise a un pozo de células. Incubar las células a 37 grados centígrados y 5% dióxido de carbono.
Y 72 horas después de la transfección, tirar de las células trans infectadas, contarlas y prepararse para el enriquecimiento por FACS. Después de confirmar los eventos de focalización en la población mixta de células diana, comience a generar clones de una sola célula preparando con antelación el medio condicionado por jurkat, mediante la recolección de RPMI con antibióticos de células T de jurkat sanas y no tratadas. Centrifugar los tubos durante 5 minutos a 300 G, y filtrar el sobrenadante con una jeringa de 25 mililitros, utilizando un filtro de 0,22 micrómetros en nuevos tubos cónicos de 50 mililitros.
Contar las células objetivo previamente enriquecidas por FACS, 10 a 14 días después de la expansión, y luego diluirlas en RPMI con antibióticos a una concentración de 100.000 células por mililitro. Diluir 100 microlitros de esta dilución celular con 9,9 mililitros de medio para alcanzar 1.000 células por mililitro. Luego diluir un mililitro de esta dilución con nueve mililitros de medio a una concentración de 100 células por mililitro.
Para platear 96 placas de pozo para que contengan una célula por pozo, mezcle suavemente un mililitro de solución de 100 células por mililitro con cinco mililitros de condición medio y cuatro mililitros de medio fresco, en un depósito de reactivo estéril. Luego, utilice una pipeta multicanal para agregar 100 microlitros de la dilución celular respectiva por pozo de nuevas placas inferiores redondas de 96 pozos para lograr una y dos células por diluciones de pozos. Apilar las 96 placas de pozo y cubrir cada pila con una placa de seis pozos que contiene tres mililitros de PBS por pozo.
Incubar las placas a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada con un 5% de dióxido de carbono, durante tres semanas. Después de la incubación completa, confirmar visualmente la presencia de colonias cultivadas utilizando microscopía de luz con aumento cuatro veces, y marcar los pozos con colonias cultivadas. Resuspender suavemente las células de uno marcado bien por pipeteo.
Transfiera 100 microlitros de esta suspensión celular en un pozo de placa inferior redonda de 96 pozos recién preparada con 100 microlitros de RPMI con antibióticos, por pozo y repita para todos los pozos marcados, mezcle suavemente por pipeteo. Para duplicar la placa, transfiera 100 microlitros de esta suspensión celular a una segunda placa de fondo redondo de 96 pozos vacía y repita este proceso para todos los pozos marcados. Por último, llene los pozos en blanco con 200 microlitros de RPMI con antibióticos.
Incubar las placas a 37 grados centígrados y 5% dióxido de carbono. Después de que la placa duplicada ha incubado durante 24 a 48 horas duplicar de nuevo mediante la adición de 100 microlitros de RPMI con antibióticos a cada pozo. Utilice una pipeta multicanal para mezclar suavemente y transferir 100 microlitros a cada pozo de una nueva placa de fondo redondo de 96 pozos.
Coloque una de estas dos placas duplicadas en la incubadora. Utilice la segunda de las nuevas placas duplicadas para la citometría de flujo, añadiendo primero cinco microlitros de PMA/Ionomicina Master Mix por pozo, para estimular las células. Incubar durante 24 horas y preparar las células para la citometría de flujo como se describe en el texto.
Acaruerce las celdas individuales viables en función del tamaño en la dispersión hacia delante y hacia el lado. Analizar la expresión génica del reportero fluorescente por citometría de flujo. Para examinar clones de una sola célula por PCR, diseñe imprimaciones P5 y P6 para la proyección de PCR basada en la secuencia de reportero elegida, para amplificar de 500 a 800 pares base de la secuencia del reportero.
Para pcR de control positivo, imprimaciones de diseño P7 y P8 que amplifican 630 pares base de un locus genómico no dirigido de tipo salvaje. Diseñe un tercer par de imprimación que amplifica de 500 a 600 pares base de la columna vertebral del vector de destino como control para la integración inespecífica de secuencias de columna vertebral de vector de destino. Una vez que los clones de la segunda placa duplicada hayan crecido lo suficiente, prepárelos para el cribado de PCR centrifugando primero la placa durante 10 minutos a 300-G a temperatura ambiente.
Quítese cuidadosamente el sobrenadante, asegurándose de no molestar el pellet celular. Lavar las células con 100 microlitros de PBS mediante pipeteo suave, centrifugando la placa durante cinco minutos a 300 G a temperatura ambiente. Retire el PBS y agregue 200 microlitros de tampón de lelisis por pozo.
Pipetear suavemente para mezclar y transferir la suspensión a una nueva placa PCR. Selle la placa con película de parafina e incubar durante una hora a 55 grados centígrados en un termociclador. Después de centrifugar los desechos de la célula a la velocidad máxima durante 10 minutos, transfiera el sobrenadante a una nueva placa PCR.
Agregue 10 microlitros de este licato celular a cada pozo de una placa PCR de 96 pozos llena de 110 microlitros de H2O destilado, por pozo. Luego incubar durante 10 minutos a 99 grados Celsius en un termociclo, para inactivar la proteinasa K.Use 2 microlitros de esta célula liso como plantilla y utilice una mezcla maestra de PCR comercial para cribado, control y PCR troncal. Ejecute PCR para 38 a 40 ciclos de amplificación pcR en un formato de 96 poc.
Utilice cinco microlitros de productos de PCR y ejecútelos en un gel DE TAE de 1,5% de agarosa para analizar y combinar los resultados de la citometría de flujo y la PCR, para confirmar los clones de una sola célula. La expresión génica del reportero después de la inducción de PMA/Ionomicina fue confirmada por citometría de flujo y PCR en cuatro a 12% de las células, dependiendo del sitio de integración. El análisis de PCR del ADN genómico utilizando imprimaciones para la unión de integración de cinco y tres primos, confirma que se han producido eventos de orientación.
Después de la detección de clones de una sola célula para la correcta focalización por citometría de flujo, se observaron clones con expresión génica de reportero alto, bajo y sin fluorescente. Los clones de una sola célula también fueron confirmados por PCR utilizando imprimaciones específicas de reporteros e imprimaciones de control. Los clones confirmaron que eran positivos en la detección de PCR fueron gastados y analizados más a fondo para la correcta focalización por Southern blot, utilizando una sonda específica del reportero y una unión de sonda genómica fuera del reportero.
Sólo una porción mostró los tamaños de banda correctos en el análisis de manchas del sur y había integrado heterocigió al reportero, mostrando que es importante verificar los resultados de la PCR por Southern Blot. Los clones también se analizaron mediante la secuenciación para confirmar aún más los clones positivos de una sola célula. Secuenciación del sitio objetivo:alelo homóloga, si el reportero no se había integrado, reveló mutaciones inducidas por Cas9.
Una vez dominada, la generación de líneas de reporteros de VIH se puede lograr en dos o tres meses. Antes de la segmentación, es importante dedicar suficiente tiempo a elegir un sitio de integración en el reportero adecuado y lo que quiera abordar, dependiendo de la pregunta de investigación que le gustaría abordar. Los reporteros pueden, por ejemplo, incluir diferentes elementos reguladores del VIH si se desea.
Siguiendo este procedimiento, las líneas celulares se pueden utilizar, por ejemplo, para probar el efecto de diferentes agentes de aumento de latencia en la actividad de transcripción del LTR del reportero, dependiendo de su sitio de integración. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo generar líneas de reportero de VIH específicas del sitio de integración para diseñar ARN guía y apuntar al vector, realizar ingeniería del genoma basada en CRISPR/Cas9 en células de jurkat, producir clones de una sola célula y seleccionar clones dirigidos correctamente mediante el cribado FACS y PCR. No olvide que si decide trabajar con un reportero de VIH competente para la replicación, debe trabajar bajo las condiciones de seguridad de BSL3.
