Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las enfermedades infecciosas. Con respecto a la fiebre del dengue, o fiebre Chikungunya. La principal ventaja de esta técnica en sí, es capaz de cuantificar el ARN viral de una manera sencilla y rápida.
Aunque este método puede proporcionar información sobre una investigación básica del virus, también se puede aplicar a otras investigaciones como alta a través de estudio de detección de drogas put y diagnóstico clínico contra virus populogénicos humanos. La demostración importante de este método es crítica. Como los sellos de procesamiento de muestras y un gabinete de bioseguridad son importantes para evitar la contaminación cruzada o la infección de laboratorio.
Demostrar el procedimiento será un profesor asistente y nuestro asistente técnico de nuestro laboratorio. Después de preparar la plantilla de ADN para el estándar de ARN, mezcle la reacción de transcripción in vivo con 100 nanogramos de la plantilla de ADN preparada en un tubo pcR de 0,2 mililitros. Incubar a 37 grados centígrados en un termocicrador durante dos horas.
Después de esto, añadir un microlitro de DNAase y continuar la incubación a 37 grados Celsius durante 15 minutos. Establezca un kit de purificación de ARN y añada 80 microlitros de agua libre de ARNAaa y 350 microlitros de tampón de captura, incluyendo 1%betamarcaptoetanol a la mezcla de reacción en un tubo de 1,5 mililitros. Añadir 250 microlitros de 100% etanol y utilizar una pipeta para mezclar.
A continuación, ensamble una columna de purificación de ARN con un tubo de recogida. Transfiera la muestra de ARN a la columna de purificación. Centrifugar la columna a 8.000 veces G durante 15 segundos y deseche el flujo a través.
A continuación, aplique 500 microlitros de tampón de lavado a la columna y centrifugar a 8.000 veces G durante dos minutos. Después de esto, coloque la columna en un tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitros. Añadir 50 microlitros de agua libre de RNAase e incubar a temperatura ambiente durante un minuto.
Centrifugar la columna a la velocidad máxima durante un minuto para allute el ARN. Usando un espectrofotómetro, mida la densidad óptica de 3 microlitros del ARN autósico a 260 nanómetros. Entonces, determine el número de copia del virus del dengue sintetizado tres ARN UTR primo.
Almacene el estándar de ARN a menos 80 grados centígrados hasta que esté listo para usar. En primer lugar, mezclar 199 microlitros de tampón de procesamiento con un microlitro de proteína libre de nucleasa K.Utilizando medio de cultivo celular, diluir en serialmente el virus del dengue preparado tres ARN UTR primo uno a diez para obtener estándares de ARN en concentraciones que van desde 5, 000, 000 a 5.000 copias por microlitro mediante la repetición de pipeteo y vórtice. Transferir 5 microlitros del sobrenadante de cultivo de las células infectadas por el virus del Dengue y el virus del dengue 3 estándar de ARN UTR primo a las tiras de PCR A2 o a los pozos de una placa PCR de 96 pozos.
Mezclar en cinco microlitros de la solución que contiene el tampón de procesamiento y la proteinasa K.Centrifuge brevemente a 200 veces G durante cinco segundos. Incubar las muestras en un termocicnador a 25 grados centígrados durante diez minutos y luego a 75 grados centígrados durante cinco minutos. Usando el virus de dengue tres imprimaciones específicas de UTR de primera calidad y una sonda fluorogénica, prepare una mezcla maestra de PCR RTQ con un reactivo RT PCR de un solo paso en un tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitros.
Asecuente ocho microlitros de la mezcla maestra en un pozo de una placa PCR en tiempo real de 96 pozos. A continuación, agregue dos microlitros de cada muestra a cada pozo de la placa PCR en tiempo real de 96 pozos. Selle la placa con una película adhesiva ópticamente transparente.
Centrifugar brevemente las placas a 200 veces G durante cinco segundos para eliminar cualquier burbuja de aire. A continuación, coloque la placa en un instrumento PCR en tiempo real. Usando un software asociado PCR en tiempo real, navegue a la ventana de configuración y asigne el pozo de una reacción que se analizará como la muestra desconocida.
A continuación, asigne el pozo del virus de dengue diluido en serie tres ARN UTR primo como estándar y escriba el número de copia esperado del estándar de ARN en cada pozo. Asigne el control que no es de plantilla como control negativo. A continuación, inicie el instrumento RT PCR y circule la placa como se describe en el protocolo de texto.
En la ventana de análisis, haga clic en analizar y asegúrese de que el coeficiente de correlación de la curva estándar generada es equivalente o superior a 0,98. Por lo general, utilice la configuración de TC predeterminada para el análisis. En este estudio, una dilución en serie diez veces del ARN estándar del virus del dengue se somete a un análisis directo de PCR RTQ utilizando tres imprimaciones específicas de UTR primos y una sonda fluorgénica.
La curva lineal de este análisis muestra que la correlación es buena. A continuación, se aplica este ensayo directo de PCR RTQ para cuantificar el virus del dengue en el sobrenadante de cultivo de las células infectadas por el virus. Se observa una buena correlación entre el título de infección por el virus del dengue y la TC, un número de ciclo que se considera el punto en el que la señal fluorescente se eleva con un crecimiento exponencial por encima del fondo.
Cuando los valores de TC generados a partir de una dilución en serie del material de virus del dengue con títulos infecciosos conocidos se trazan en la curva estándar generada anteriormente, se observa que los datos de las muestras que oscilan entre 08 y 8, 000 PFU por reacción están dentro del rango de los sometidos a ARN estándar. Esto indica que las muestras de virus del dengue con una amplia gama de títulos infecciosos se pueden analizar al mismo tiempo cuando se utiliza esta técnica. Este ensayo se evalúa además por su aplicabilidad a la validación de agentes antivirales contra el virus del Dengue.
Cuando se trata con 50 microgramos por mililitro de MPA, se observa una reducción de aproximadamente el 99,87% del cultivo de control tratado con DMSO. Por último, se prueban las aplicaciones de este ensayo con otros virus de ARN. Cuando un stock de cepa de vacuna 17D del Virus de la Fiebre Amarilla se somete a PCR RTQ directo, se genera una curva estándar con una buena correlación directa entre los títulos del virus y los valores de TC.
Del mismo modo, el análisis directo de RTQ PCR del virus del sarampión y las tensiones de cepa cruda del virus del chikungunya da una buena regresión entre los títulos infecciosos y los valores de TC. Esta técnica allanará el camino para los investigadores en el campo del estudio de cribado. Permitir que un gran número de muestras explore nuevos fármacos antivirales es igual a simplista.
No olvide que trabajar con materiales refe infecciosas puede ser extremadamente peligroso y las precauciones tales como el uso de equipos de protección personal y un gabinete de bioseguridad limpia siempre deben tomarse mientras se realiza este procedimiento.
