Name: evaluating the role of mitochondrial function in cancer-related fatigue
Uploaded: 2018-05-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
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Este estudio es apoyado completamente por la división de investigación intramuros del Instituto Nacional de enfermería investigación de los NIH, Bethesda, Maryland.

El presente estudio (NCT00852111) fue aprobado por la Junta de revisión institucional (IRB) de los institutos nacionales de salud (NIH), Bethesda, Maryland. Los participantes inscritos en este estudio eran eutímicos, 18 años de edad o más, que fueron diagnosticados con cáncer de próstata no metastásico con o sin previa prostatectomía y fueron programados para recibir radioterapia de haz externo (EBRT). Los participantes potenciales fueron excluidos si tenían una enfermedad progresiva que puede causar fatiga significativa, tenían enfermedad psiquiátrica dentro de los últimos cinco años, tenía sin corregir el hipotiroidismo o anemia, o tenía una segunda malignidad. También se excluyeron los individuos que usaron sedantes, esteroides o agentes antiinflamatorios no esteroides. Se obtuvieron muestras de sangre de control sano en la medicina de los NIH Departamento de transfusión de donantes sanos bajo un protocolo aprobado por el IRB (NCT00001846). Todos los participantes son reclutados en el Magnuson Clinical Research Center en el NIH. Firmado Consentimientos informados escritos se obtuvieron antes de la participación en el estudio.
1. preparación de la medición de la función mitocondrial (día 1 del experimento)
<ol><li>Cartucho Sensor del hidrato (véase Tabla de materiales; duración aproximada: 5 minutos).<ol>
<li>Retire el cartucho de Sensor de paquete. Añadir 200 μL Calibrant solución en cada pocillo de la placa de la utilidad, luego llenar cada foso con 400 μL Calibrant solución.</li>
		<li>Devuelva el Sensor de la placa a la placa de la utilidad, que ahora tiene solución Calibrant. Hidratar el cartucho en un incubador de 37 º C sin CO2 durante la noche. Nota: Cartucho Sensor necesita estar hidratado para un mínimo de 4 h y un máximo de 72 h.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparación de la muestra clínicos (día 2 del experimento)
<ol><li>Medir la fatiga mediante el artículo 13 funcional evaluación de enfermedad la terapia crónica - fatiga (FACIT-F)2,23,24 al inicio (antes de la iniciación de la EBRT), punto medio y completar EBRT y 1 año post-TRHE.<ol>
<li>Utilice un 0 - 4 escala de respuesta de cada elemento, donde 0 representa "nada" y 4 indica que el demandado refiere a la instrucción correspondiente "mucho." Puntaje total debe estar comprendida desde 16-53, con puntuaciones más bajas que reflejan la intensidad alta fatiga.</li>
		<li>Definir la fatiga como una puntuación de FACIT-F inferior a 43, con una puntuación de FACIT-F de ≥43 indicando ausencia de o no significativo clínicamente fatiga2. Nota: Una puntuación de FACIT-F 43 mejor divide puntuaciones de fatiga de pacientes con cáncer y la población general2.</li>
		<li>Incluyen los siguientes 13 artículos en la escala de fatiga de FACIT: 1) me siento fatigado; 2) me siento débil todo más; 3) me siento apático ("lavado hacia fuera"); 4) me siento cansado; 5) tengo problemas para iniciar cosas porque estoy cansado; 6) tengo problemas para terminar las cosas porque estoy cansado; 7) tengo energía; 8) soy capaz de hacer mis actividades habituales; 9) es necesario dormir durante el día; 10) estoy demasiado cansado para comer; 11) necesito ayuda para hacer mis actividades habituales; 12) me siento frustrado por estar demasiado cansado para hacer las cosas que quiero hacer; y 13) tengo que limitar mi actividad social porque estoy cansado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aislar PBMC de muestras de sangre recién recogidas (duración aproximada: 1 h).<ol>
<li>Recoger 8 mL de sangre en un tubo de preparación de células mononucleares (véase Tabla de materiales). Nota: Las muestras de sangre deben procesarse dentro de las 2 h de colección. La calidad de PBMCs puede verse comprometida si las muestras de sangre se procesan más de 2 h después de la recogida de muestras.</li>
		<li>Centrifugue a 1.750 x g durante 30 min a temperatura ambiente (18-25 ° C). Transferir la capa turbia en un tubo cónico de 15 mL. Añadir hasta 15 mL de PBS e invertir 5 veces.</li>
		<li>Centrifugar a 300 x g durante 15 minutos a 4 ° C. Cuidadosamente retire y descarte el sobrenadante sin pellets inquietante. Resuspender el pellet agregando a 10 mL de PBS e invierta 5 veces.</li>
		<li>Centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 ° C. Descarte el líquido sobrenadante y Resuspenda las células en 1 mL de PBS. Transferir las PBMCs de un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.</li>
		<li>Centrifugue a 610 x g durante 10 minutos. Cuidadosamente Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado en completo RPMI-1640 (RPMI-1640 suplementado con 10% FBS, 10 mM penicilina/estreptomicina).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Capa de placas de células para que las células no adherentes (duración aproximada: 30 min).<ol>
<li>Preparar la solución adhesiva de células y tejidos (véase Tabla de materiales) diluyendo la solución madre en bicarbonato de sodio, 0.1 M pH 8.0. La solución de trabajo deben de 3.5 μg/cm2 de superficie. Nota: Esta solución contiene proteínas polifenólicos extraídas de lo marino mejillón, Mytilus edulis. Estas proteínas son componentes clave del pegamento secretada por el mejillón para anclarse a las superficies. Nos encontramos con que Cell-Tak funciona mejor con PBMCs.</li>
		<li>Añadir 100 μL de la solución de pegamento diluida en cada pocillo e incubar durante al menos 20 min a temperatura ambiente. Lavar tres veces con agua desionizada y aire seco.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. medición de la función mitocondrial
<ol><li>Preparación de medios de ensayo (duración aproximada: 10 minutos). Nota: Los medios de ensayo deben ser recién preparados en el día del experimento.<ol>
<li>Añadir L-glutamina piruvato y glucosa a la base de los medios de comunicación (los mismo componentes como el medio modificado Eagle de Dulbecco (DMEM), sin bicarbonato de sodio, glucosa, glutamina o piruvato de sodio) para hacer los medios de ensayo. Calentar el medio a 37 ° C, luego ajustar el pH a 7,4. Nota: Las concentraciones de L-glutamina, piruvato y glucosa son generalmente las mismas concentraciones en medios de crecimiento normal, pero pueden ser ajustadas en base a lo análisis.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar la prueba de estrés de Mito PBMCs (duración aproximada: 2 h).<ol>
<li>Placa suficiente PBMCs del paso 2 en cada pozo para llegar a 80-90% de confluencia. En nuestra experiencia, 1,5 x 105 células/pozo produjo los resultados más consistentes. Nota: Pozos A y H son los pozos de fondo y sólo deben contener los medios de análisis sin las células. En pozos B a G, se recomienda al menos 3-6 pocillos por muestra del paciente de la galjanoplastia para explicar afloramientos.</li>
		<li>Girar las placas de abajo a 200 x g durante 2 minutos permitir que las células se adhieran al fondo de los pozos. Lavar las células una vez con los medios de ensayo. Este paso quita suero y bicarbonato de sodio desde el medio de crecimiento. Nota: En nuestra experiencia, el paso de lavado quita típicamente 20-30% de las células.</li>
		<li>Añadir 180 medios de ensayo μL en cada pocillo, incluyendo pozos de fondo A y H. Incubar en una incubadora de 37 ° C no CO2 durante 45-60 minutos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realizar la prueba de estrés de Mito<ol>
<li>Reconstituir los fármacos en el Kit de estrés de Mito con los medios de ensayo como sigue:<ol>
<li>Oligomycin: Agregar medios de ensayo μL 252 en el frasco para generar una solución de reserva a 50 μM.</li>
			<li>FCCP: Añadir 288 μL del medio de ensayo en el frasco para generar una solución de reserva a 50 μM.</li>
			<li>Antimycin A / rotenona: 216 añadir μL de medios de ensayo en el vial para generar una solución stock a 25 μM.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Drogas de vórtice reconstituido durante aproximadamente 1 minuto. Diluir en soluciones de trabajo. Nota: Las concentraciones de las soluciones de trabajo deben ser graduadas y predeterminadas antes del experimento según el tipo de célula. Para PBMCs, encontramos que 1 μM de Oligomycin, 1 μM FCCP y 0.5 μM antimycin A / rotenona funcionan mejor.</li>
		<li>Pipetear las drogas en cada puerto en el cartucho de sensor secuencialmente:<ol>
<li>Puerto A: Pipeta de 20 μL de 10 μM Oligomycin, para una concentración final en cada pozo de 1 μM.</li>
			<li>Puerto B: pipeta 22 μL de 10 μM FCCP, para una concentración final en cada pozo de 1 μM.</li>
			<li>Puerto C: Pipeta 25 μL de 5 μM antimycin A / rotenona para una concentración final en cada pozo de 0.5 μM.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Seleccione "Test de estrés de Mito" en un instrumento de flujo extracelular. Siga sistema de instrumento e inserte el cartucho de sensor. El instrumento realizará automáticamente la calibración del sensor. Inserte la placa de la célula después de calibración del sensor y el instrumento terminará el resto del ensayo. Dinámica de oxígeno se mide a 530 nm (excitación) / 650nm (emisión), y concentración de protón se mide a 470 nm (excitación) / 530 nm (emisión).</li>
</ol>4. normalización de los datos de la función mitocondrial
<ol><li>Preparar la solución de ensayo de proliferación celular (duración aproximada: 5 minutos).<ol>
<li>Añadir 48 μL de ácido nucleico mancha (x 500) y supresor de fondo 240 μL a 11,7 mL PBS (x 2). La mancha de ácido nucleico es un colorante florescente de la célula de ADN, y el supresor de fondo es un tinte de enmascaramiento que bloquea las células muertas o células con integridad de la membrana de la célula comprometida de ser manchado. La combinación del tinte de unión al ADN y el supresor de fondo asegura que se tiñen las células sólo vivas.</li>
		<li>Añadir un volumen igual de 2 x solución de trabajo (180 μL) directamente en el medio en cada pozo ha finalizado la prueba de estrés de Mito.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubar las células en presencia de solución de ensayo de proliferación celular en una incubadora de 37 ° C durante 45-60 minutos cuantificar el número de células vivas (fluorescente) en un lector de placas a 508 nm (excitación) / 527 nm (emisión) y normalizar datos OCR (duración aproximada: 10 minutos) . Nota: además de las células energizadas número, los usuarios pueden elegir también a normalizar sus datos con el número total de células, cantidad de ácido nucleico, las concentraciones de proteína, etcetera.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Berger, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-Related+Fatigue,+Version+2.2015.">Cancer-Related Fatigue, Version 2.2015.</a> Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 13 (8), 1012-1039 (2015).</li><li>Feng, L. R., Dickinson, K., Kline, N., Saligan, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+phenotyping+approaches+lead+to+dissimilar+biologic+profiles+in+men+with+chronic+fatigue+following+radiation+therapy.">Different phenotyping approaches lead to dissimilar biologic profiles in men with chronic fatigue following radiation therapy.</a> Journal of Pain and Symptom Management. 52 (6), 832-840 (2016).</li><li>Feng, L. 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Los autores no tienen nada que revelar.

La fatiga en pacientes con cáncer es una condición debilitante que no está bien definido o caracterizado1. Diagnóstico de fatiga se basa enteramente en informes subjetivos y no hay estándar actual de diagnóstico o tratamiento para esta condición, en gran parte debido a la falta de entendimiento en el pathobiology2. De los mecanismos propuestos que fatiga en pacientes con cáncer, deterioro de la función mitocondrial es uno de los caminos más terapéutico targetable...

La fatiga es una condición frecuente y angustiante que tiene un impacto negativo en la calidad de vida de pacientes de cáncer1. Hasta la fecha, fatiga del cáncer sigue siendo mal definida y se basa sólo en información subjetiva de pacientes2. Por lo tanto, hay una necesidad urgente de identificar una prueba de laboratorio de diagnóstico fácilmente adaptable para caracterizar objetivamente la fatiga en el ajuste clínico3,4.
Se han propuesto múltiples mecanismos subyacentes, incluyendo la disfunción de las mitocondrias, que causan fatiga5. Las mitocondrias son los orgánulos de potencia, ofreciendo el 95% de las necesidades de energía celular por fosforilación oxidativa y juegan un papel importante en la señalización de calcio, apoptosis, señalización inmune y regulación de otros de eventos de señalización intracelular6 . Por consiguiente, alteración bioenergética mitocondrial y defectos en la producción de energía pueden contribuir a la fatiga. Apoyando esta hipótesis, estudios anteriores han observado mutaciones en el ADN mitocondrial en pacientes con síndrome de fatiga crónica7. Aunque no está claro si el origen fisiopatológico de la fatiga se encuentra dentro del sistema nervioso central o periférico tejidos, como músculos esqueléticos8,9, no existe ningún método directo para valorar con precisión disfunción mitocondrial se relaciona con fatiga en células vivas, respiran.
Utilizando células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) para el estudio de la función mitocondrial ofrece varias ventajas. En primer lugar, PBMCs están disponibles en el ajuste clínico mediante flebotomía estándar y pueden ser aislados rápidamente utilizando técnicas de laboratorio básicas. En segundo lugar, la recogida de sangre es menos invasiva que recoger otros tejidos tales como una biopsia del músculo. Así, recogieron muestras de sangre pueden ser del mismo paciente repetidamente en el tiempo, que facilita la evaluación longitudinal de los efectos del tratamiento. Curiosamente, la función mitocondrial en PBMCs parece correlacionarse bien con estado mitocondrial renal en un modelo animal10. Además, las mitocondrias de la célula inmune se han utilizado como un proxy para la detección de cambios sistémicos en enfermedad diferentes condiciones11,12. Las mitocondrias en las células inmunes circulantes son particularmente sensibles a los cambios en las funciones inmunológicas e inmune señalización moléculas como citoquinas13,14,15. Por ejemplo, se ha observado que PBMCs de pacientes con enfermedades inflamatorias reumáticas agudas exhiben alta base oxígeno consumo14. En contraste, el consumo de oxígeno se redujo en PBMCs aisladas de pacientes con condiciones inflamatorias sistémicas incluyendo sepsis16. En condiciones inflamatorias, radicales libres producidos por las mitocondrias disfuncionales pueden contribuir al elevado estrés oxidativo y la inflamación prolongada17. El papel central de las mitocondrias en la producción de energía, así como en el estrés oxidativo sugiere la posible utilidad del uso de la función mitocondrial como un proxy para el estudio de la fatiga en pacientes de cáncer 13.
Estudios anteriores que examinan la función mitocondrial utilizan técnicas bioquímicas, medición de potencial de membrana mitocondrial o aislamiento de poblaciones celulares específicas que no pueden ser fácilmente adaptables en el ajuste clínico5, 14,18. En los últimos años, el desarrollo de ensayos de flujo extracelular ha permitido a los investigadores a fácilmente y con precisión examinar los cambios en la tasa de consumo de oxígeno (OCR) en respuesta a las inyecciones automatizadas de inhibidores respiratorios19,20 , 21 , 22. sin embargo, la mayoría de estos estudios está diseñada para tipos específicos de la célula y el gran formato de alto rendimiento puede no ser aplicable en un ajuste clínico. En este manuscrito, se describe un protocolo optimizado para examinar la función mitocondrial para uso clínico.

<table><tbody><tr><td>CPT Mononuclear Cells Preparation Tube&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>362761</td><td>For isolating PBMCs following phlebotomy</td></tr><tr><td>RPMI-1640&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>10-040</td><td>For making growth media for PBMCs</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td>For making growth media for PBMCs</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td>For making growth media for PBMCs</td></tr><tr><td>Cell-Tak</td><td>Corning</td><td>354240</td><td>Cell and Tissue adhesive solution; allows suspension cells to adhere to the surface</td></tr><tr><td>Seahorse XF Calibrant Solution</td><td>Agilent</td><td>103059-000</td><td>For hydrating cartridges</td></tr><tr><td>XFp Fluxpak (miniplates and sensor cartridges)</td><td>Agilent</td><td>103022-100</td><td>Contains XFp cell culture miniplates and sensor cartridges</td></tr><tr><td>XF base media</td><td>Agilent</td><td>103335-100</td><td>For making XF assay media</td></tr><tr><td>45% cell culture D-(+)-Glucose solution</td><td>Corning</td><td>25-037-CI</td><td>For making XF assay media</td></tr><tr><td>Sodium pyruvate solution</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>25-000-CI</td><td>For making XF assay media</td></tr><tr><td>L-glutamine solution</td><td>ThermoFisher</td><td>25030081</td><td>For making XF assay media</td></tr><tr><td>Seahorse XFp Mito Stress Test Kit</td><td>Agilent</td><td>103010-100</td><td>Contains oligomycin, FCCP, antimycin A/rotenone</td></tr><tr><td>CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay</td><td>ThermoFisher</td><td>C35011</td><td>For quantification of live cells and data normalization</td></tr><tr><td>Seahorse XFp Analyzer</td><td>Agilent</td><td>S7802AEA</td><td>For measuring mitochondrial function in live cells</td></tr><tr><td>Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (or any instrument that can quantify fluorescent cells in a plate)</td><td>BioTek</td><td>BTCYT5PV</td><td>For quantification of live cells and data normalization</td></tr></tbody></table>

evaluating the role of mitochondrial function in cancer-related fatigue

La fatiga es común y debilitante condición que afecta a la mayoría de los pacientes cáncer. Hasta la fecha, restos de fatiga mal caracterizados con ningún diagnóstico prueba para medir objetivamente la severidad de esta condición. Aquí describimos un método optimizado para la evaluación de la función mitocondrial de PBMCs recogidos de pacientes fatigados. Usando un sistema compacto de flujo extracelular y secuencial inyección de inhibidores respiratorios, examinamos estado funcional mitocondrial PBMC midiendo el básica respiración mitocondrial, capacidad respiratoria y fenotipo de energía, que describe la vía preferida de energía para responder al estrés. PBMCs frescos están disponibles en el ajuste clínico mediante flebotomía estándar. El ensayo completo que se describe en este protocolo se puede completar en menos de 4 horas sin la participación de técnicas bioquímicas complejas. Además, se describe un método de normalización que es necesario para obtener datos reproducibles. Los métodos de procedimiento y normalización simple presentados permiten para recolección de muestras repetidas del mismo paciente y generación de datos reproducibles que pueden compararse entre puntos de tiempo para evaluar los efectos potenciales del tratamiento.

Los Test de estrés del Mito se basa en medir la tasa de consumo de oxígeno (OCR) después de la inyección secuencial de varios inhibidores respiratorios para asignar un perfil mitocondrial completo. Mediciones de OCR después de cada inyección de la droga puede utilizarse para calcular los siguientes parámetros relacionados con la salud mitocondrial: OCR Basal se mide primero antes de cualquier inyección de la droga para evaluar el consumo de oxígeno necesario para...

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Evaluating the Role of Mitochondrial Function in Cancer-related Fatigue

Nuestro objetivo era desarrollar un protocolo práctico para evaluar la disfunción mitocondrial asociada a fatiga en pacientes con cáncer. Este innovador protocolo está optimizado para uso clínico que implica flebotomía estándar y procedimientos básicos de laboratorio.

Evaluar el papel de la función mitocondrial en la fatiga relacionada con el cáncer

Fatigue is a common and debilitating condition that affects most cancer patients. To date, fatigue remains poorly characterized with no diagnostic test to ...

evaluating-role-mitochondrial-function-cancer-related

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Cancer Research

9.1K vistas.  National Institutes of Health. Nuestro objetivo era desarrollar un protocolo práctico para evaluar la disfunción mitocondrial asociada a fatiga en pacientes con cáncer. Este innovador protocolo está optimizado para uso clínico que implica flebotomía estándar y procedimientos básicos de laboratorio.

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Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic pathways is tested in many types of tumors. Thus, characterization of cancer cell metabolic setup is inevitable in order to target the correct pathway to improve the overall outcome of patients. Unfortunately, in a majority of cancers, the malignant cells are quite difficult to obtain in higher numbers and the tissue biopsy is required. Leukemia is an exception, where a sufficient number of leukemic cells can be isolated from the bone marrow. Here, we provide a detailed protocol for the isolation of leukemic cells from leukemia patients bone marrow and subsequent analysis of their metabolic state using extracellular flux analyzer. Leukemic cells are isolated by the density gradient, which does not affect their viability. The next cultivation step helps them to regenerate, thus the metabolic state measured is the state of cells in optimal conditions. This protocol allows achieving consistent, well-standardized results, which could be used for the personalized therapy.

Here we present a protocol for the isolation of leukemic cells from leukemia patients bone marrow and analysis of their metabolic state. Assessment of the metabolic profile of primary leukemia cells could help to better characterize the demand of primary cells and could lead up to more personalized medicine.

Evaluación del perfil metabólico de las células leucémicas primarias

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

The Treadmill Fatigue Test: A Simple, High-throughput Assay of Fatigue-like Behavior for the Mouse

Fatigue is a prominent symptom in many diseases and disorders and reduces quality of life for many people. The lack of clear pathogenesis and failure of current interventions to adequately treat fatigue in all patients leaves a need for new treatment options. Despite the therapeutic need and importance of preclinical research in helping identify promising novel treatments, few preclinical assays of fatigue are available. Moreover, the most common preclinical assay used to assess fatigue-like behavior, voluntary wheel running, is not suitable for use with some strains of mice, may not be sensitive to drugs that reduce fatigue, and has relatively low throughput. The current protocol describes a novel, non-voluntary preclinical assay of fatigue-like behavior, the treadmill fatigue test, and provides evidence of its efficacy in detecting fatigue-like behavior in mice treated with a chemotherapy drug known to cause fatigue in humans and fatigue-like behavior in animals. This assay may be a beneficial alternative to wheel running, as fatigue-like behavior and potential interventions can be assessed in a greater number of mice over a shorter time frame, thus permitting faster discovery of new therapeutic options.

Fatigue is a common, undertreated and frequently poorly-understood symptom in many diseases and disorders. New preclinical assays of fatigue may help to improve current understanding and future treatment of fatigue. To that end, the current protocol provides a novel means of measuring fatigue-like behavior in the mouse.

El Ensayo de fatiga rueda de ardilla: Un ensayo sencillo, de gran procesamiento de comportamiento a fatiga similar para el ratón

Fatigue is a prominent symptom in many diseases and disorders and reduces quality of life for many people. The lack of clear pathogenesis and failure of ...

Comportamiento

Analytical Determination of Mitochondrial Function of Excised Solid Tumor Homogenates

Mitochondria are essential to the onset and progression of cancer through energy production, reactive oxygen species regulation, and macromolecule synthesis. Genetic and functional adaptations of mitochondria to the tumor environment drive proliferative and metastatic potential. The advent of DNA and RNA sequencing removed critical barriers to the evaluation of genetic mediators of tumorigenesis. However, to date, methodological approaches to evaluate tumor mitochondrial function remain elusive and require technical proficiency limiting the feasibility, ultimately diminishing diagnostic and prognostic value in both experimental and clinical settings. Here, we&#160;outline a simple and rapid method to quantify rates of oxidative phosphorylation (OXPHOS) and electron transfer (ET) capacity in freshly excised solid tumor homogenates using high-resolution respirometry. The protocol can be reproducibly applied across species and tumor types as well as adapted to evaluate a diversity of mitochondrial ET pathways. Using this protocol, we demonstrate that mice bearing a luminal B mammary cancer exhibit defective nicotinamide adenine dinucleotide-linked respiration and reliance on succinate to generate adenosine triphosphate via OXPHOS.

We developed a practical protocol and analytical approach to evaluate mitochondrial oxidative phosphorylation and electron transfer capacity in fresh tumor homogenates. This protocol can be easily adapted to survey various mitochondrial functions that contribute to cancer initiation, progression, and treatment response.

Determinación analítica de la función mitocondrial de homogeneizados de tumores sólidos extirpados

Mitochondria are essential to the onset and progression of cancer through energy production, reactive oxygen species regulation, and macromolecule ...

Generación de cíbridos transmitocondriales a partir de células cancerosas en crecimiento en suspensión

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more efforts are still needed to fully understand the link involving alterations in mitochondria and tumorigenesis, as well as to identify tumor-associated mitochondrial phenotypes. For instance, to evaluate the contribution of mitochondria in tumorigenesis and metastasis processes, it is essential to understand the influence of mitochondria from tumor cells in different nuclear environments. For this purpose, one possible approach consists of transferring mitochondria into a different nuclear background to obtain the so-called cybrid cells. In the traditional cybridization techniques, a cell line lacking mtDNA (&#961;0, nuclear donor cell) is repopulated with mitochondria derived from either enucleated cells or platelets. However, the enucleation process requires good cell adhesion to the culture plate, a feature that is partially or completely lost in many cases in invasive cells. In addition, another difficulty found in the traditional methods is achieving complete removal of the endogenous mtDNA from the mitochondrial-recipient cell line to obtain pure nuclear and mitochondrial DNA backgrounds, avoiding the presence of two different mtDNA species in the generated cybrid. In this work, we present a mitochondrial exchange protocol applied to suspension-growing cancer cells based on the repopulation of rhodamine 6G-pretreated cells with isolated mitochondria. This methodology allows us to overcome the limitations of the traditional approaches, and thus can be used as a tool to expand the comprehension of the mitochondrial role in cancer progression and metastasis.

Autor destacado: Generación de cíbridos transmitocondriales utilizando líneas celulares cancerosas  

This protocol describes a technique for cybrid generation from suspension-growing cancer cells as a tool to study the role of mitochondria in the tumorigenic process.

Generación cíbrida transmitocondrial utilizando líneas celulares cancerosas

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more ...

Assessing Mitochondrial Function in Sciatic Nerve by High-Resolution Respirometry

Mitochondrial dysfunction in peripheral nerves accompanies several diseases associated with peripheral neuropathy, which can be triggered by multiple causes, including autoimmune diseases, diabetes, infections, inherited disorders, and tumors. Assessing mitochondrial function in mouse peripheral nerves can be challenging due to the small sample size, a limited number of mitochondria present in the tissue, and the presence of a myelin sheath. The technique described in this work minimizes these challenges by using a unique permeabilization protocol adapted from one used for muscle fibers, to assess sciatic nerve mitochondrial function instead of isolating the mitochondria from the tissue. By measuring fluorimetric reactive species production with Amplex Red/Peroxidase and comparing different mitochondrial substrates and inhibitors in saponin-permeabilized nerves, it was possible to detect mitochondrial respiratory states, reactive oxygen species (ROS), and the activity of mitochondrial complexes simultaneously. Therefore, the method presented here offers advantages compared to the assessment of mitochondrial function by other techniques.

High-resolution respirometry coupled to fluorescence sensors determines mitochondrial oxygen consumption and reactive oxygen species (ROS) generation. The present protocol describes a technique to assess mitochondrial respiratory rates and ROS production in the permeabilized sciatic nerve.

Evaluación de la función mitocondrial en el nervio ciático mediante respirometría de alta resolución

Mitochondrial dysfunction in peripheral nerves accompanies several diseases associated with peripheral neuropathy, which can be triggered by multiple ...

Bioquímica

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo and noninvasively in humans via phosphorus-31 magnetic resonance spectroscopy (31PMRS). However, the approach has not been widely adopted in translational and clinical research, with variations in methodology and limited guidance from the literature. Increased optimization, standardization, and dissemination of methods for in vivo 31PMRS would facilitate the development of targeted therapies to improve OXPHOS capacity and could ultimately favorably impact cardiovascular health. 31PMRS produces a noninvasive, in vivo measure of OXPHOS capacity in human skeletal muscle, as opposed to alternative measures obtained from explanted and potentially altered mitochondria via muscle biopsy. It relies upon only modest additional instrumentation beyond what is already in place on magnetic resonance scanners available for clinical and translational research at most institutions. In this work, we outline a method to measure in vivo skeletal muscle OXPHOS. The technique is demonstrated using a 1.5 Tesla whole-body MR scanner equipped with the suitable hardware and software for 31PMRS, and we explain a simple and robust protocol for in-magnet resistive exercise to rapidly fatigue the quadriceps muscle. Reproducibility and feasibility are demonstrated in volunteers as well as subjects over a wide range of functional capacities.

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

This work demonstrates the feasibility of an in vivo phosphorus-31 magnetic resonance spectroscopy (31PMRS) technique to quantify mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity in human skeletal muscle.

El fósforo-31 espectroscopía de resonancia magnética: una herramienta para medir<em&gt; En Vivo</em&gt; Capacidad de la fosforilación oxidativa mitocondrial en el músculo esquelético humano

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Medicina

Real-Time Measurement of the Mitochondrial Bioenergetic Profile of Neutrophils

Neutrophils are the first line of defense and the most abundant leukocytes in humans. These effector cells perform functions such as phagocytosis and oxidative burst, and create neutrophil extracellular traps (NETs) for microbial clearance. New insights into the metabolic activities of neutrophils challenge the early concept that they primarily rely on glycolysis. Precise measurement of metabolic activities can unfold different metabolic requirements of neutrophils, including the tricarboxylic acid (TCA) cycle (also known as the Krebs cycle), oxidative phosphorylation (OXPHOS), pentose phosphate pathway (PPP), and fatty acid oxidation (FAO) under physiological conditions and in disease states. This paper describes a step-by-step protocol and prerequirements to measure oxygen consumption rate (OCR) as an indicator of mitochondrial respiration on mouse bone marrow-derived neutrophils, human blood-derived neutrophils, and the neutrophil-like HL60 cell line, using metabolic flux analysis on a metabolic extracellular flux analyzer. This method can be used for quantifying the mitochondrial functions of neutrophils under normal and disease conditions.

We describe stepwise protocols measuring the mitochondrial respiration of mouse and human neutrophils and HL60 cells using the metabolic extracellular flux analyzer.

Medición en tiempo real del perfil bioenergético mitocondrial de neutrófilos

Neutrophils are the first line of defense and the most abundant leukocytes in humans. These effector cells perform functions such as phagocytosis and ...

Inmunología e Infección

Use of Minimally Invasive Methods to Assess Fuel Utilization and Circadian Rhythms in Older Adults

Aging is associated with multiple physiological changes that contribute synergistically and independently to physical disability and the risk of chronic disease. Although the etiology of age-related physical disability is complex and multifactorial, the decline in mitochondrial function appears to coincide with the progression of functional decline in many older adults. The reason why there is a decrease in mitochondrial function with aging remains elusive, but emerging science indicates that both fuel metabolism and circadian rhythms can influence mitochondrial function.
Recent studies have established that circadian rhythms become disturbed with aging, and that disrupted circadian rhythms have pathological consequences that impact mitochondrial function and overlap with many age-associated chronic diseases. Current quantitative methods for direct assessment of mitochondrial function are invasive and typically require a muscle biopsy, which can pose difficulties with participant recruitment and study adherence, given the perceived levels of potential pain and risk. Thus, an innovative and relatively noninvasive protocol to assess changes in mitochondrial function at the cellular level and circadian patterns in older adults was adapted. Specifically, a real-time metabolic flux analyzer is used to assess the mitochondrial bioenergetic function of white blood cells under differential substrate availability.
The expression of circadian clock genes in white blood cells to cross-correlate with the mitochondrial bioenergetics and circadian rhythm outcomes are also analyzed. It is believed that these innovative methodological approaches will aid future clinical trials by providing minimally invasive methods for studying mitochondrial substrate preference and circadian rhythms in older adults.

A novel and minimally invasive protocol is presented to evaluate the synergistic impact of fuel utilization and circadian rhythms on aging individuals, utilizing peripheral blood mononuclear cells.

Aging is associated with multiple physiological changes that contribute synergistically and independently to physical disability and the risk of chronic ...

Evaluar el papel de la función mitocondrial en la fatiga relacionada con el cáncer

Resumen

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Capítulos en este video

Evaluación del perfil metabólico de las células leucémicas primarias

El Ensayo de fatiga rueda de ardilla: Un ensayo sencillo, de gran procesamiento de comportamiento a fatiga similar para el ratón

Determinación analítica de la función mitocondrial de homogeneizados de tumores sólidos extirpados

Generación cíbrida transmitocondrial utilizando líneas celulares cancerosas

Generación cíbrida transmitocondrial utilizando líneas celulares cancerosas

Generación cíbrida transmitocondrial utilizando líneas celulares cancerosas

Evaluación de la función mitocondrial en el nervio ciático mediante respirometría de alta resolución

El fósforo-31 espectroscopía de resonancia magnética: una herramienta para medir

Medición en tiempo real del perfil bioenergético mitocondrial de neutrófilos

Use of Minimally Invasive Methods to Assess Fuel Utilization and Circadian Rhythms in Older Adults