Name: intestinal stem cell isolation and culture in a porcine model of segmental small intestinal ischemia
Uploaded: 2018-05-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intestinal Stem Cell Isolation and Culture in a Porcine Model of Segmental Small Intestinal Ischemia at JoVE.com

Este proyecto fue apoyado por K01OD0199 de NIH, NIH T32 OD011130, NIH P30DK034987 y Dpto. de Ciencias clínicas difusión fondos

Para estos experimentos, todos los estudios en animales fueron aprobados por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) de North Carolina State University.
1. preparación para la cultura
Nota: Todos los reactivos se enumeran en la Tabla de materiales. Concentraciones de factor de crecimiento específico se enumeran en la tabla 1.
<ol><li>Preparar una solución de ácido (EDTA) 0,5 m. etilendiaminotetracético en agua desionizada destilada (ddH2O). Mezclar adecuadamente y ajustar el pH a 7.4 con soluciones de NaOH o HCl. Nota: Constituyen solución EDTA fresca antes de cada experimento.</li>
	<li>Prepare el reactivo de disociación #1 (DR #1) como sigue y coloque en hielo: combinar fosfato tampón salino sin Ca2 + y Mg2 + (PBS), 0,5 M de EDTA, 1 M 1, 4-Dithiothreitol (DTT), 10 μm Y27632 y solución antibiótico-antimicótico de X 1 (anti Anti-) que contiene penicilina, estreptomicina y anfotericina B. Nota: Agregar Y27632 inmediatamente antes de la recogida de tejido.</li>
	<li>Prepare el reactivo de disociación #2 (DR #2) como sigue y colocar en un baño de agua de 37 ° C: combinar PBS sin Ca2 + y Mg2 +, 0,5 M de EDTA, 10 μm Y27632 y 1 X anti-Anti. Nota: Agregar Y27632 inmediatamente antes de la recogida de tejido.</li>
	<li>Preparar los medios de comunicación de células epiteliales intestinales (IESC) como sigue: mezclar 25 mL avanzado medio DMEM/F12 con suplemento de N2 X 1, 1 X B-27 suplemento, 10 mM HEPES, 2 mM Glutamax y 1 X anti-Anti. Almacenar a 4 ° C hasta su uso.</li>
	<li>Preparar una mezcla maestra de reducido factor de crecimiento de la membrana del sótano (matriz) y factores de crecimiento suplementarios como sigue: descongelar la matriz en el hielo. En un tubo de microcentrífuga, añadir 100 ng/mL Noggin humano recombinante, 500 ng/mL recombinante humana 1 R-Spondin, 50 ng/mL recombinante humana factor de crecimiento epidérmico (EGF), 100 ng/mL Wnt3a recombinante de humano, nicotinamida, gastrina 10 de nM, de 10 mM 500 nM A-83-01, 10 μm Y-27632 , SB202190 de 10 m m, 500 nM LY2157299 y 2.5 μm glucógeno sintasa 3 inhibidor de la cinasa (GSK3i, CHIR99021). Cuando la matriz es descongelada, complementar con la mezcla de factor de crecimiento (haciendo la mezcla principal) y almacenar en hielo. Nota: Tenga cuidado de no introducir burbujas de aire ya que esto va crear artefacto dentro de la empanada de la matriz durante la galjanoplastia.</li>
	<li>Precalentar un plato 24-well cultivo de tejidos en una incubadora de 37 ° C antes de iniciar procedimientos de aislamiento celular.</li>
</ol>2. quirúrgico modelo de isquemia y colección de tejido
<ol><li>Uso ocho a diez semanas de edad Yorkshire cruza cerdos de ambos sexos (recomendado). Eliminar todo alimento 16-18 h antes de la cirugía. Acceder a los cerdos al agua en todo momento.</li>
	<li>Programar los cerdos para llegar por lo menos 48 h antes de los experimentos para permitir la aclimatación ambiental. Nota: Técnicos capacitados de veterinaria o laboratorio bajo la supervisión de un veterinario con licencia proveen cuidado rutinario de los animales y asistencia en procedimientos anestésicos.</li>
	<li>Premedicate el cerdo con xilacina (1,5 mg/kg por vía intramuscular (IM)) y ketamina (11-20 mg/kg (IM))15. Una vez tranquilo, intubar la orotracheally de cerdo.</li>
	<li>Mantener los cerdos bajo anestesia general con isoflurano (2-5%) vaporizado en el 100% O2 hasta el momento de la eutanasia.</li>
	<li>Colocar un catéter (IV) intravenoso (vena de la oreja se recomienda) y administrar un fluido de reemplazo como solución de Ringer a una tasa de mantenimiento de 15 mL/kg/h.</li>
	<li>Realizar anestesia monitorización incluyendo oximetría de pulso, Electrocardiografía y presión arterial indirecta medidas15. Vigilar frecuencia respiratoria y el esfuerzo del Chancho y ventile manualmente o mecánicamente según sea necesario si extremo marea CO2 se eleva por encima de 55-60 mmHg. Nota: Anestesia adecuada es confirmada por la supervisión continua de las tendencias de frecuencia cardíaca (rango 80-130 lat/min), presión arterial no invasiva (media presión arterial 75-100 mmHg) y frecuencia respiratoria (10-25 respiraciones/min)16y verificación periódica ausencia de mandíbula y tono anal. Profundidad de la anestesia también puede ser juzgado por el grado de relajación muscular y fasciculaciones de los músculos tras estímulo quirúrgico. Reflejos oculares suelen ser de ningún valor16. Puede proporcionar analgesia según las indicaciones de la política de las instituciones IACUC. En este caso un opiáceo, como la buprenorfina, puede ser administrado durante la cirugía.</li>
	<li>Coloque el cerdo en una almohada y restringir en recumbency dorsal para el procedimiento quirúrgico.</li>
	<li>Afeitar el abdomen ventral y preparación mediante lavado quirúrgico (solución de clorhexidina) y alcohol isopropílico.</li>
	<li>Hacer una incisión de 8-10 cm de la línea media ventral usando una hoja de bisturí, centrada en el ombligo para acceder el abdomen.</li>
	<li>Identificar el intestino delgado (yeyuno) oral aproximadamente 40 cm hasta la Unión ileocecal. Delinear lazos largo 10 cm de yeyuno por ligadura circunferencial el intestino dos veces, un centímetro entre cada ligadura, antes de crear posteriores lazos 10 cm localizado por vía oral (figura 1).</li>
	<li>Crear dos circuitos por cada punto del tiempo de isquemia adyacentes entre sí, uno para isquemia y otro para la isquemia con una 1h adicional de reperfusión si lo desea. Para crear la isquemia completa (no flujo de las arterias o venas), abrazadera o ligar la vasculatura mesentérica con pinzas vasculares bulldog, curva pinzas hemostáticas de mosquito de Halstead o seda no absorbible 2-0 para 1, 2, 3 y 4h y luego retire las abrazaderas para 1h de reperfusión, si lo desea. Nota: Los autores crearon todos los bucles de la isquemia en orden comenzando por el bucle isquémica 4h y progresaban hacia proximal (minimizar el tiempo total de la cirugía). Para hacer frente a la posibilidad de que los vecinos de segmentos de intestino isquémicos pueden dañar lazos adyacentes, se puede variar el orden de las asas isquémicas. Esto puede alterar el tiempo quirúrgico total. Nota: El tiempo de reperfusión puede variar en base a la pregunta de investigación de interés o si las terapias desean analizarse durante el período de reperfusión. Sin embargo, como daño a los tejidos se convierte en más grave del aumento de duración de la isquemia solo, reperfusión probablemente no contribuye a más lesiones epiteliales. Reperfusión probablemente desempeñan un papel tras periodos leves de lesión isquémica.</li>
	<li>Entre puntos de tiempo de isquemia, mantener el abdomen cubierto o cerrado utilizando una toalla estéril o una abrazadera de toalla. Nota: Dentro de un solo animal para este experimento, se pueden crear ocho segmentos isquémicos. Identificar un segmento yeyunal adicional, por lo menos 5-10 cm proximal al último bucle isquémico, que servirá como un control interno normal.</li>
	<li>Obstruir aproximadamente tres recipientes mesentéricos por bulldog pinza vascular o curva pinza hemostática mosquito de Halstead. Debe tenerse cuidado durante la aplicación de la pinza porque los vasos están fácilmente traumatizados. Tratar de apilar los vasos entre las mordazas de las pinzas.</li>
	<li>Al final del experimento, siguiente eutanasia pentobarbital 85-100 mg/kg IV, recoge todos los bucles de tejido con tijeras de metzenbaum, después de la muerte ha sido confirmada sin auscultar latido y pérdida del reflejo corneal. Empezar por recoger una pieza de control de yeyuno normal por lo menos 5 - 10 cm proximal al último bucle isquémico.</li>
	<li>Separar y almacenar los lazos de cada momento de la lesión en pequeños recipientes de PBS helado hasta que esté listo para el aislamiento de la cripta. Nota: Si lo desea, hacer isquémica bucles de tiempo suficiente para dividir las muestras separadas para la histología y cultivo de células madre intestinales; sin embargo, los autores han encontrado que lazos más de aproximadamente 10 cm de largo son más propensos a convertirse en hemorrágica.</li>
</ol>3. cripta (células madre) aislamiento de isquémica y lazos de Control
<ol><li>Invertir cada lazo del pequeño intestino usando un alambre de calibre 20 y fórceps de tejido para exponer la superficie de la mucosa. Atar la parte superior e inferior del asa firmemente al cable mediante sutura (seda no absorbible 2-0 o equivalente).</li>
	<li>Después de la inversión, enjuague cada bucle en PBS frío hielo para quitar escombros luminal.</li>
	<li>Coloque inmediatamente las muestras en tubos cónicos de 50 mL que contiene DR #1 en hielo durante 30 minutos.</li>
	<li>Bucles de control a partir de recoger y seguir con lazos de progresivamente aumentar la duración de la isquemia. Bucles de menos tejido dañado (es decir, control y 1 h tejido isquémico) pueden agitarse con fuerza, ajustando la muñeca para obtener mejores resultados. Tejidos de tejido dañado severamente (3 y 4 h de isquemia) deben sacudió suavemente o invertidos solamente como demasiada agitación causará interrupción de cripta y destrucción del tejido adicional. Tubos deben agitarse o invertidos cada 5 min en el hielo.</li>
	<li>Transferir las muestras a DR #2 para 10 min en un baño de agua de 37° C. Sacuda o invertir los tubos cada 5 min.</li>
	<li>Después de transferir los tejidos, centrifugar los tubos cónicos que contienen DR #1 de los bucles de 2-4 h dañada para eliminar el EDTA sobrenadante (200 x g durante 5 min). Como estos tejidos están muy dañados es posible que las criptas ya han se disocian. Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet con un pequeño volumen de PBS (5 mL) y continúe con el paso 3.9.</li>
	<li>Extraer muestras de DR #2 y colocar las muestras de tejido directamente en 25 mL de PBS frío en hielo (etiqueta como lavado #1). Coloque las muestras en un agitador orbital de hielo a 60 rpm. Seguir a agitar o invertir cada tubo por 30 s cada 2 a 5 min.</li>
	<li>Después de la transferencia a los tejidos, hacer girar los tubos cónicos con DR #2 de 2-4 h dañados lazos para eliminar el EDTA sobrenadante (200 x g durante 5 min). Como estos tejidos están muy dañados es posible que las criptas han se disocian. Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet con un pequeño volumen de PBS (5 mL) y continúe con el paso 3.9.</li>
	<li>Sacar una alícuota de 50 μl de lavado #1 (o de la República Dominicana) para comprobar el grado de disociación de la cripta y cantidad de residuos. Coloque el tejido en un tubo cónico de 50 mL nuevo (lavado #2, #3, etc.) llenos con 25 mL de frío PBS y agitar hasta que están aisladas con residuos mínimos y vellosidades criptas intactas. Nota: El objetivo es ser capaz de aislar una fracción limpia de criptas intactas y desperdicios mínimos. Cada lavado adicional limpiará las células sin embargo demasiada agitación comenzará a causar daño de célula de tejido secundario. Además, se logrará los mejores resultados con menos contaminación si criptas están revestidas de un paso de lavado y no de un paso de reactivo de disociación.</li>
	<li>Remover el tejido restante Centrifugue los tubos cónicos de 50 mL a 200 x g durante 5 minutos para eliminar el sobrenadante y resuspender restante la pelotilla de la cripta en menor volumen de PBS (5 mL).</li>
	<li>Usando un microscopio invertido, examinar 50 alícuotas de μl de cada muestra para determinar el número de criptas/fracción. La meta es 50-100 criptas/50 μL, como será el tamaño de la empanada de la matriz final. Nota: Si la muestra es demasiado concentrada, continuar a añadir PBS frío hasta que se alcance la concentración deseada. Si la muestra está muy diluida, determinar número de alícuotas necesarias para alcanzar el rendimiento deseado de la cripta y ajustar.</li>
	<li>Alícuotas o los volúmenes apropiados de las criptas (determinados por observaciones alícuotas) en un tubo de microcentrífuga. Por ejemplo, si la muestra contiene 50 μl de criptas/50 alícuotas de 50 μL por patty X 3 repeticiones = 150 μL / tubo de microcentrífuga. Si la muestra sólo contiene 25 μl de criptas/50 2 alícuotas necesitadas patty X 3 Replica = 300 μL/tubo.</li>
	<li>Criptas de pellets a 200 x g durante 5 min a 4° C.</li>
	<li>Resuspender suavemente granuladas criptas con volumen apropiado de mezcla principal (50 μL por pocillo). Mezclar bien mediante pipeteo rápidamente 15 veces sin crear burbujas de aire. Nota: Pre-enfriar la punta de la pipeta con PBS estéril fría antes de aspirar la mezcla principal. Esto le ayudará a mantener la mezcla principal de separarse hacia fuera. Consejos pueden mantenerse en el refrigerador y colocados en la campana inmediatamente antes de usar.</li>
	<li>Dispensar un 50 μl mezclar maestro más gotas de la cripta en centro de cada pocillo de una placa bien 24 precalentado.</li>
	<li>Incubar la placa de cultivo durante 30 min a 37 ° C.</li>
	<li>Superpón cada patty matriz con 500 μl / pozo de medios IESC (no otros factores de crecimiento necesarios en el día 0 como están contenidas dentro de la mezcla principal).</li>
	<li>Añadir 500 μl PBS estéril a cualquier pocillos no utilizados en la placa para mantener la humedad.</li>
	<li>Contar el número de criptas enchapadas en el día 0. Nota: Es útil a la red cada célula cultura placa en cuadrantes para asegurar la cuenta más exacta.</li>
	<li>Contar número de enterospheres cada 24 h y vigilar para el desarrollo de enteroide diariamente.</li>
	<li>Añadir factores de crecimiento para cada bien cada 48 h. Quite los medios de comunicación IESC cada 96 h y reemplácelo con medio fresco de 500 μl (factores de crecimiento debe añadirse a los medios de comunicación).</li>
</ol>

<ol>
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Los autores no tienen nada que revelar.

El desarrollo de un modelo porcino de isquemia intestinal segmentaria amplía modelos murinos anteriores permitiendo el estudio de varios puntos de tiempo de lesión del tejido en el mismo animal. Hay varios puntos de la discusión crítica de este protocolo, incluyendo ligadura de vaso adecuado, la reperfusión del tejido y cultivo de células de la cripta exitosa.
Ligadura de vaso adecuada es esencial para la creación de un modelo de isquemia completa. Si la sutura se ata irregularmente o la abrazadera no apretó totalmente, sangre de la arteria de pared gruesa puede continuar entrar en el tejido y no puede salir por el colapso de la vena de paredes delgadas. Esto resulta en extravasación de sangre en la lámina propia que causa daño tisular adicional. Sin embargo, dependiendo del tipo de lesión isquémica en estudio, puede desear la isquemia completa o hemorrágica. Por ejemplo, en el proceso de trasplante intestinal, el intestino completamente es separado de la fuente vascular (arteria y vena) durante la fase de resección del procedimiento, que resulta en isquemia intestinal completa. Como alternativa, sin embargo, cuando el mesenterio está doblado durante un evento como un vólvulo intestinal, el retorno venoso es a menudo obstruido en primer lugar, hacia la sangre adicional dentro del tejido antes de la fuente arterial obstruido, creando así hemorrágica isquemia.
Lesión isquémica resulta en daño a los tejidos a partir de la punta de la vellosidad y extendiéndose hasta el fondo de la cripta3. Durante la isquemia, energía en forma de trifosfato de adenosina se sigue utilizando y genera la hipoxantina metabolito. Cuando el tejido está reperfused con oxígeno, hipoxantina llega a ser metabolizado por la xantina oxidasa y produce radicales libres de superóxido llevando a lesión de la mucosa y la atracción de neutrófilos17,18de daño del tejido. Diferencias de especie en arquitectura vascular mucosa así como la expresión diversa de la xantina oxidasa, resultan en diferentes grados de lesión de la reperfusión3. Felinos y roedores modelos de isquemia-reperfusión son más susceptibles a daño por reperfusión de metabolitos de oxígeno reactivo19,20. Por el contrario, los cerdos fueron encontrados para tener menos xantina oxidasa y por lo tanto, menos daño por reperfusión, hacer este modelo más comparable a la de isquemia intestinal humano21. En este momento, el uso de nocaut o modelos porcinos transgénicos para estudiar el daño intestinal no se ha descrito, haciendo de este una limitación importante de este modelo. Selección del modelo animal adecuado depende del proceso de enfermedad o condición específica que el investigador desea estudiar. Por ejemplo, modelos porcinos de lesión isquémica hasta 6 h han sido descrito22, considerando que los procedimientos más isquémicos en modelos murinos se 45-60 min23.
Aislamiento exitoso de las criptas intestinales del intestino normal y ischemically dañado permite el estudio de la recuperación epitelial en la cultura. Este sistema permite al investigador a centrarse únicamente en el epitelio sólo como fuente no vascular o células inmunitarias componente a considerar. Esto ofrece la oportunidad de estudiar las interacciones de la célula epitelial y la recuperación después de la lesión además de la respuesta a diferentes factores de crecimiento o tratamientos administrados durante la cirugía o siguientes aislamiento cripta complementando los medios de cultivo. Este paso es el más difícil, como aislamiento de los lazos severamente dañados requiere agitación suave y rápida eliminación de las soluciones que contienen el EDTA en el caso de las criptas tienen se prematuramente disocian. Si estos lazos del intestino no se lavan bien, las criptas tienen el potencial de contaminación en la cultura. Como resultado, ambas soluciones Dr. Además de los medios de comunicación IESC añadido solución antibiótico-antimicótico. Otro punto de discusión se centra en el intestino como un control normal. Como los animales se someten a anestesia con posibles alteraciones en la perfusión sistémica tejido, junto con la posibilidad de circulación de mediadores inflamatorios secundarios a la isquemia, tejido de control incluso "normal" puede no representar un verdadero control. En estos experimentos, es de nota que el tejido de control aparecieron grueso e histológico comparable al tejido de animales que no se someten a isquemia en otros experimentos (González, L.M., datos no publicados, 2017).
En Resumen, este método describe un modelo reproducible de la isquemia intestinal porcina, que modela de cerca lo que ocurre en humano lesión isquémica. Además, se describe el aislamiento de células intestinales de bucles isquémicas, que sirve para estudiar la reparación epitelial y posible respuesta al tratamiento en la cultura.

Lesión isquémica intestinal, el resultado de la disponibilidad de oxígeno disminuida debido a una reducción u obstrucción completa del flujo de sangre al intestino, sigue siendo una causa significativa de morbilidad y mortalidad en pacientes humanos y animales1,2. Daño isquémico, junto con la posterior inflamación y la infiltración celular, conduce al compromiso de la barrera mucosa. La barrera mucosa es fundamental para la prevención de la traslocación bacteriana y las toxinas asociadas a la circulación sistémica3,4. La posterior reperfusión de los tejidos isquémicos puede resultar en formación de dañar especies reactivas de oxígeno que pueden exacerbar la lesión5. Puesto que rara vez pueden prevenir isquemia intestinal, la investigación más actual ha centrado en el avance de las técnicas para la detección temprana de la isquemia y el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos que reducen la reparación mucosa lesiones o meta de la reperfusión.
Modelos animales se han utilizado para ampliar nuestro conocimiento de ciencia básica de isquemia-reperfusión y siendo imprescindible para la investigación traslacional. Modelos de roedores han sido los más utilizados debido a su capacidad para ser manipulado genéticamente6. Más recientemente sin embargo, el uso de modelos animales grandes, especialmente el cerdo, se ha abogado para futuros estudios traslacionales debido a una serie de ventajas como las similitudes anatómicas y fisiológicas del cerdos a los seres humanos7,8. Han desarrollado una variedad de modelos de la lesión para estudio de isquemia-reperfusión e incluyen oclusión vascular completa, bajo flujo isquemia y oclusión vascular mesentérica segmentaria. Una revisión completa de estos modelos es fuera del ámbito de este artículo sin embargo los autores lectores para una reciente revisión3.
Además de modelos en vivo , el uso de sistemas de cultivo celular ex vivo ofrece una herramienta prometedora para el estudio de la homeostasis intestinal y la reparación posterior a la lesión. Las células madre intestinales son responsables de la proliferación celular y la cifra de negocios de la guarnición epitelial intestinal. Cuando aislado de intestino normal o lesionado, células intestinales puede ser mantenidas en la cultura y servir como herramienta o modelo para el estudio de células madre y biología de la célula epitelial. Métodos para aislar y establecer estas tres dimensiones de la cultura sistemas (llamados enteroids y colonoids cuando deriva del intestino pequeño y grande, respectivamente) se han descrito una variedad de especies y órganos sistemas9,10 ,11,12,13. Específicamente, en el tracto gastrointestinal, estos sistemas de cultivo se han utilizado para enfermedades gastrointestinales modelo incluyendo cáncer, infección del patógeno y de la enfermedad inflamatoria intestinal14. En este momento, no hay ningún informe que describe el aislamiento y mantenimiento de células intestinales del intestino ischemically lesionado en cualquier especie. Por lo tanto, aquí describimos el proceso de isquemia intestinal en un modelo porcino animal grande, novela que resulta en lesión reproducible y la capacidad de aislar células madre intestinales del intestino normal y ischemically lesionado para el estudio adicional de recuperación de ex vivo.

<table><tbody><tr><td>Phosphate Buffered Saline, Ca2+, Mg 2+ free</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>BP-399</td><td>Dilute 1:10</td></tr><tr><td>Distilled, deionized water (ddH2O)</td><td></td><td></td><td>Used to prepare EDTA and PBS</td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Thermo Scientific</td><td>20688</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediamene tetraacetic acid (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>ED45</td><td>Make fresh before each experiment; pH 7.4</td></tr><tr><td>1,4-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>N2 Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630-106</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B</td><td>Gibco</td><td>15240-096</td><td>Anti-Anti solution</td></tr><tr><td>Recombinant human Wnt-3a</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>5036 WN/CF</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human Rspondin1</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>4645- RS</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human Noggin</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>6057-NG</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human EGF</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>236-EG</td><td></td></tr><tr><td>LY2157299</td><td>SelleckChem</td><td>52230</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Cayman Chemical</td><td>13122</td><td></td></tr><tr><td>Human [leu]15-Gastrin 1</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9145</td><td></td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma Aldrich</td><td>57067</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Acetic Acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>Water, WFI Quality</td><td>Corning, Inc.</td><td>25-055-CM</td><td>Referred to as sterile water (SW); for growth factor stocks</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matrix, GFR</td><td>Corning, Inc.</td><td>356231</td><td>Phenol red free</td></tr><tr><td>24 Well Culture Dish</td><td>Corning, Inc.</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>Conical Tube, 50 ml&amp;nbsp;</td><td>Corning, Inc.</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel Handle</td><td>World Precision Instruments</td><td>500236</td><td></td></tr><tr><td>Carbon Steel Surgical Blade, No. 10</td><td>World Precision Instruments</td><td>504169</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>15918</td><td></td></tr><tr><td>Debakey Tissue Forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>501239</td><td></td></tr><tr><td>Mayo Scissors</td><td>World Precision Instruments</td><td>501752</td><td>Curved or straight</td></tr><tr><td>Metzenbaum Scissors</td><td>World Precision Instruments</td><td>501739</td><td></td></tr><tr><td>Mosquito Forceps, Curved</td><td>World Precision Instruments</td><td>503724-12</td><td>Curved or straight (503728-12)</td></tr><tr><td>Hopkins Bulldog Clamp</td><td>Stoelting Co.</td><td>52120-40P</td><td>Straight</td></tr><tr><td>Silk, 2-0&amp;nbsp;</td><td>Henry Schein</td><td>685S-BUT</td><td>Any similar brand is acceptable</td></tr><tr><td>Towel Clamps</td><td>World Precision Instruments</td><td>501700</td><td></td></tr><tr><td>Needle Holder</td><td>World Precision Instruments</td><td>V503382</td><td></td></tr><tr><td>Wire suture, 20 gauge</td><td>Henry Schein</td><td>19075</td><td>Cut and straighten before use.</td></tr><tr><td>Surgical Towels</td><td>Henry Schein</td><td>ST1833</td><td>Any similar product is acceptable.</td></tr><tr><td>Lactated Ringers Solution</td><td>Henry Schein</td><td>9851</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhex antiseptic scrub (4%)</td><td>Henry Schein</td><td>VINV-CHMX-SCRB</td><td>Any similar brand is acceptable</td></tr><tr><td>Isopropyl Alcohol 70%</td><td>Henry Schein</td><td>MS071HS</td><td>Any similar brand is acceptable</td></tr><tr><td>IV catheter, 22 gauge</td><td>Henry Schein</td><td>2225PUR</td><td>May need 20g or 24 g depending on size of the vein</td></tr><tr><td>Xylazine (100 mg/ml)</td><td>Henry Schein</td><td>33198</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine (100 mg/ml)</td><td>Henry Schein</td><td>11695-6835-1</td><td>Controlled medication</td></tr><tr><td>Isoflurane solution</td><td>Henry Schein</td><td>10015516</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital (Fatal Plus Euthanasia Solution (390 mg/ml))</td><td>Vortech Pharm.</td><td></td><td>Multiple brands of Pentobarbital Sodium available.</td></tr><tr><td>Heating pad&amp;nbsp;</td><td>Gaymar</td><td></td><td>Tpump Core Warming System; others are available.</td></tr><tr><td>Mindray Datascope Monitor</td><td>Mindray North America</td><td></td><td>Any equivalent piece of monitoring equipment acceptable</td></tr><tr><td>Vaporizer&amp;nbsp;</td><td>Vetland Medical</td><td></td><td>Recommended to use a Circle System w/ Y piece; multiple suppliers available.</td></tr><tr><td>Fluid Pump</td><td>Abbott Hospira</td><td></td><td>Plum A+; Any similar manufacturer is recommended.</td></tr></tbody></table>

intestinal stem cell isolation and culture in a porcine model of segmental small intestinal ischemia

Isquemia intestinal sigue siendo una causa importante de morbilidad y mortalidad en pacientes humanos y veterinarios. Muchos procesos de la enfermedad como resultado de isquemia intestinal, al disminuir el suministro de sangre y oxígeno al intestino. Esto nos lleva a la pérdida de la barrera intestinal y daño al tejido subyacente. Células intestinales de la madre residen en la base de las criptas de Lieberkühn y son responsables de renovación intestinal durante la homeostasis y las siguientes lesiones. Ex vivo las técnicas de cultivo celular han permitido el estudio exitoso de células madre epiteliales interacciones mediante el establecimiento de las condiciones de cultivo que favorecen el crecimiento de sistemas de órgano como epiteliales tridimensionales (denominado "enteroids" y" colonoids"en el intestino pequeño y grande respectivamente). Estos enteroids son compuesto de cripta y vellosidad-como dominios y maduros contienen todos los tipos de células que se encuentran dentro del epitelio. Históricamente, se han utilizado modelos murinos para estudiar el daño intestinal. Sin embargo, un modelo porcino ofrece varias ventajas incluyendo la similitud de tamaño, así como gastrointestinal anatomía y fisiología a la de los seres humanos. Utilizando un modelo porcino, establecemos un protocolo en que lazos segmentarios de la isquemia intestinal puede crearse dentro de un solo animal, que permite el estudio de los diferentes puntos de lesión isquémica de tiempo y reparar en vivo. Además, se describe un método para aislar y la cultura de las células intestinales de los lazos isquémicas del intestino, lo que permite el estudio continuo de reparación epitelial, modulada por las células de vástago, ex vivo.

Isquemia intestinal completa fue creada en pequeños bucles intestinales utilizando oclusión vascular con sutura o grapas como se muestra en la figura 1. Soltando las abrazaderas, puede realizarse un período controlado de la reperfusión, lo que permite un estudio adicional de lesión de la reperfusión posterior si lo desea. Todos los animales sobrevivieron durante el procedimiento con la mínima complicación hasta la eutanasia. La complicación quirúrgica más frecuente fue la hipotensión, que resolvió con la suplementación de un positivo inotrópico como la dobutamina.
Si se realiza correctamente, lesión isquémica comenzará en la punta de la vellosidad intestinal y migran hacia abajo dentro de la cripta como la duración de los aumentos de isquemia (figura 2). Un error común con la técnica quirúrgica puede ocurrir cuando los vasos sanguíneos no ligados o afianzado con abrazadera uniformemente. El resultado es una isquemia hemorrágica (figura 3), en la que la vena de paredes delgadas se derrumba antes de la arteria, permitiendo sangre adicional para infiltrarse en los tejidos. Esto se ve manifiestamente como una superficie serosal púrpura oscurezca (figura 3, izquierda) en comparación con una superficie más clara durante la isquemia completa (figura 3, derecha).
Después del retiro de las asas intestinales isquémicas, criptas intestinales se aislaron con éxito siguiendo el protocolo de la disociación (figura 4). Como era de esperar, criptas de horarios más severamente dañado a menudo se rompieron (f; fragmento) y fracciones de la cripta contienen detritos celulares más fondo en comparación con aquellos que experimentaron no o daño leve. Durante el protocolo, el intestino severamente lesionado debe agitarse suavemente para evitar daños a los tejidos subyacentes. Sacude demasiado áspero puede resultar en daño adicional de la cripta y la mayoría de las criptas en el DR las soluciones que contienen EDTA, dando por resultado la interrupción adicional.
Una vez plateado, criptas desde todos los puntos de tiempo de isquemia sobreviven y son capaces de establecerse en la cultura (figura 5). Cuando criptas intestinales normales y levemente dañadas se platean en la cultura, forma de enterospheres dentro de las 24-48 h. Con daño isquémico severo (3 y 4 h), las criptas intestinales sobrevivirán pero que están dañadas, resultando en la formación de esferas mucho más pequeñas inicialmente. 72-120 h, enteroids convertido en más compleja con evidente lúmenes central y estructuras de florecimiento. En general, existe una eficiencia de crecimiento disminución de las criptas, así como una disminución del tamaño de enteroids derivados del tejido intestinal severamente dañado (González, L.M., datos no publicados, 2017).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig1.jpg"> Figura 1 : Modelo quirúrgico mas isquemia intestinal en un modelo porcino. A) yeyuno porcino normal que exteriorizado. B) mesentéricos buques han sido ligados con sutura creación de isquemia intestinal. C) isquemia creada con pinzas vasculares bulldog para permitir la reperfusión del tejido si se desea. D) vasculatura intestinal inmediatamente después del retiro de las abrazaderas vasculares. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig2.jpg"> Figura 2 : Evidencia histologic (hematoxilina y eosina (H & E) Mancha) de aumento de daño epitelial después de más larga duración de isquemia intestinal completada. Daño comienza en la punta de la vellosidad con pérdida gradual de la capa epitelial de la célula, vellosidad embotar y daño celular que se extiende a la cripta con lesiones graves (hasta 4 h duración). barra de escala de 100 μm. I = isquemia. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig3.jpg"> Figura 3 : Evidencia bruto e histologic de la hemorrágica isquemia. A) fotografía bruto comparando hemorrágica isquemia (lazo izquierdo) y la isquemia completa (lazo de la derecha). Cuando la vasculatura no ligada o afianzado con abrazadera uniformemente, sangre puede continuar para infiltrarse en los tejidos, resultando en daños e inflamación adicional. B) H & E imágenes de hemorrágica isquemia de aumento de la duración de 1-4 h. Además de daño celular considerado isquemia completa, existen evidencias de infiltración de glóbulos rojos dentro de la lámina propia circundante. barra de escala de 100 μm. I = isquemia. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig4.jpg"> Figura 4 : Alícuotas de criptas intestinales aisladas por los lazos del intestino isquémico y normal de. Completadas, intactas criptas intestinales (asteriscos) se aislaron con éxito de cada asa del intestino. Como era de esperar, criptas de más puntos de tiempo severamente dañado a menudo se rompieron (f; fragmento) y fracciones de la cripta contienen detritos celulares más fondo en comparación con aquellos que experimentaron no o daño leve. barra de escala de 100 μm. I = isquemia. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig5.jpg"> Figura 5 : Curso del tiempo de crecimiento de células intestinales tras aislamiento de lazos isquémicas del intestino pequeño. Cuando criptas intestinales normales fueron plateadas en la cultura, enterospheres formado dentro de las 24-48 h. Con daño isquémico severo (3 y 4 h), criptas sobrevivirán pero forman esferas mucho más pequeñas inicialmente. 72-120 h, enteroids convertido en más compleja con evidente lúmenes central y estructuras de florecimiento. 20 μm escala bar si no se indica. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Factor de crecimiento</td>
			<td>Diluyente</td>
			<td>Concentración stock</td>
			<td>Dilución de stock</td>
			<td>Dilución de trabajo</td>
		</tr>
<tr>
<td>R-Spondin</td>
			<td>PBS</td>
			<td>100 X</td>
			<td>100 μg/ml</td>
			<td>1 μg/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Noggin</td>
			<td>SW/0.1%BSA</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>100 μg/ml</td>
			<td>100 ng/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>EGF</td>
			<td>10mM de ácido acético</td>
			<td>10.000 X</td>
			<td>500 μg/ml</td>
			<td>50 ng/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>A-83-01</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>500 ΜM</td>
			<td>500 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>SB202190</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>3000 X</td>
			<td>30 mM</td>
			<td>10 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nicotinamida</td>
			<td>SW</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>1 M</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gastrina</td>
			<td>PBS</td>
			<td>10.000 X</td>
			<td>100 ΜM</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Y-27632</td>
			<td>PBS</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>10 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>LY2157299</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>10.000 X</td>
			<td>5 mM</td>
			<td>0,5 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>CHIR99021</td>
			<td>PBS</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>2,5 mM</td>
			<td>2.5 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Wnt3a</td>
			<td>PBS</td>
			<td>2000 X</td>
			<td>200 μg/ml</td>
			<td>100 ng/ml</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: tabla de factor de crecimiento reactivo. Resumen de soluciones madre de factor de crecimiento y soluciones de trabajo utilizadas en el presente Protocolo.

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Intestinal Stem Cell Isolation and Culture in a Porcine Model of Segmental Small Intestinal Ischemia

Este protocolo permitirá a los lectores a establecer con éxito un modelo porcino de isquemia intestinal segmentaria y posteriormente aislar células madre intestinales para el estudio de la reparación epitelial después de lesión de la cultura.

Aislamiento de células madre intestinales y de la cultura en un modelo porcino de isquemia Intestinal pequeño segmentaria

Intestinal ischemia remains a major cause of morbidity and mortality in human and veterinary patients. Many disease processes result in intestinal ...

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Stem Cell Biology And Renewal in Epithelial Tissue

SCIENTISTS IN ACTION

10.7K vistas.  North Carolina State University. Este protocolo permitirá a los lectores a establecer con éxito un modelo porcino de isquemia intestinal segmentaria y posteriormente aislar células madre intestinales para el estudio de la reparación epitelial después de lesión de la cultura.

Video: Intestinal Stem Cell Isolation and Culture in a Porcine Model of Segmental Small Intestinal Ischemia

Tissue Engineering of the Intestine in a Murine Model

Tissue-engineered small intestine (TESI) has successfully been used to rescue Lewis rats after massive small bowel resection, resulting in return to preoperative weights within 40 days.1 In humans, massive small bowel resection can result in short bowel syndrome, a functional malabsorptive state that confers significant morbidity, mortality, and healthcare costs including parenteral nutrition dependence, liver failure and cirrhosis, and the need for multivisceral organ transplantation.2 In this paper, we describe and document our protocol for creating tissue-engineered intestine in a mouse model with a multicellular organoid units-on-scaffold approach. Organoid units are multicellular aggregates derived from the intestine that contain both mucosal and mesenchymal elements,3 the relationship between which preserves the intestinal stem cell niche.4 In ongoing and future research, the transition of our technique into the mouse will allow for investigation of the processes involved during TESI formation by utilizing the transgenic tools available in this species.5The availability of immunocompromised mouse strains will also permit us to apply the technique to human intestinal tissue and optimize the formation of human TESI as a mouse xenograft before its transition into humans. Our method employs good manufacturing practice (GMP) reagents and materials that have already been approved for use in human patients, and therefore offers a significant advantage over approaches that rely upon decellularized animal tissues. The ultimate goal of this method is its translation to humans as a regenerative medicine therapeutic strategy for short bowel syndrome.

This article and the accompanying video present our protocol for generating tissue-engineered intestine in the mouse, using an organoid units-on-scaffold approach.

Ingeniería de tejidos del intestino en un modelo murino

Tissue-engineered small intestine (TESI) has successfully been used to rescue Lewis rats after massive small bowel resection, resulting in return to ...

Investigación

Bioingeniería

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

The intestinal epithelium regenerates every 5-7 days, and is controlled by the intestinal epithelial stem cell (IESC) population located at the bottom of the crypt region. IESCs include active stem cells, which self-renew and differentiate into various epithelial cell types, and quiescent stem cells, which serve as the reserve stem cells in the case of injury. Regeneration of the intestinal epithelium is controlled by the self-renewing and differentiating capabilities of these active IESCs. In addition, the balance of the crypt stem cell population and maintenance of the stem cell niche are essential for intestinal regeneration. Organoid culture is an important and attractive approach to studying proteins, signaling molecules, and environmental cues that regulate stem cell survival and functions. This model is less expensive, less time-consuming, and more manipulatable than animal models. Organoids also mimic the tissue microenvironment, providing in vivo relevance. The present protocol describes the isolation of colonic crypts, embedding these isolated crypt cells into a three-dimensional gel matrix system and culturing crypt cells to form colonic organoids capable of self-organization, proliferation, self-renewal, and differentiation. This model allows one to manipulate the environment-knocking out specific proteins such as claudin-7, activating/deactivating signaling pathways, etc.-to study how these effects influence the functioning of colonic stem cells. Specifically, the role of tight junction protein claudin-7 in colonic stem cell function was examined. Claudin-7 is vital for maintaining intestinal homeostasis and barrier function and integrity. Knockout of claudin-7 in mice induces an inflammatory bowel disease-like phenotype exhibiting intestinal inflammation, epithelial hyperplasia, weight loss, mucosal ulcerations, epithelial cell sloughing, and adenomas. Previously, it was reported that claudin-7 is required for intestinal epithelial stem cell functions in the small intestine. In this protocol, a colonic organoid culture system is established to study the role of claudin-7 in the large intestine.

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

The present protocol describes establishing a murine colonic organoid system to study the activity and functioning of colonic stem cells in a claudin-7 knockout model.

Cultivo tridimensional de criptas colónicas murinas para estudiar la función de las células madre intestinales ex vivo

The intestinal epithelium regenerates every 5-7 days, and is controlled by the intestinal epithelial stem cell (IESC) population located at the bottom of ...

Investigación sobre el cáncer

Murine Model of Intestinal Ischemia-reperfusion Injury

Intestinal ischemia is a life-threatening condition associated with a broad range of clinical conditions including atherosclerosis, thrombosis, hypotension, necrotizing enterocolitis, bowel transplantation, trauma and chronic inflammation. Intestinal ischemia-reperfusion (IR) injury is a consequence of acute mesenteric ischemia, caused by inadequate blood flow through the mesenteric vessels, resulting in intestinal damage. Reperfusion following ischemia can further exacerbate damage of the intestine. The mechanisms of IR injury are complex and poorly understood. Therefore, experimental small animal models are critical for understanding the pathophysiology of IR injury and the development of novel therapies.
Here we describe a mouse model of acute intestinal IR injury that provides reproducible injury of the small intestine without mortality. This is achieved by inducing ischemia in the region of the distal ileum by temporally occluding the peripheral and terminal collateral branches of the superior mesenteric artery for 60 min using microvascular clips. Reperfusion for 1 hr, or 2 hr after injury results in reproducible injury of the intestine examined by histological analysis. Proper position of the microvascular clips is critical for the procedure. Therefore the video clip provides a detailed visual step-by-step description of this technique. This model of intestinal IR injury can be utilized to study the cellular and molecular mechanisms of injury and regeneration.

Here we describe the detailed procedure of intestinal ischemia-reperfusion in mice which results in reproducible injury without mortality to encourage the standardization of this technique across the field. This model of intestinal ischemia-reperfusion injury can be utilized to study the cellular and molecular mechanisms of injury and regeneration.

Modelo murino de isquemia-reperfusión intestinal Lesiones

Intestinal ischemia is a life-threatening condition associated with a broad range of clinical conditions including atherosclerosis, thrombosis, ...

Medicina

Co-Culture of Murine Small Intestine Epithelial Organoids with Innate Lymphoid Cells

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate balance of mucosal homeostasis. These 3D, multi-cellular systems offer a reductionist model for addressing multi-factorial diseases and resolving technical difficulties that arise when studying rare cell types such as tissue-resident innate lymphoid cells (ILCs). This article describes a murine system that combines small intestine organoids and small intestine lamina propria derived helper-like type-1 ILCs (ILC1s), which can be readily extended to other ILC or immune populations. ILCs are a tissue-resident population that is particularly enriched in the mucosa, where they promote homeostasis and rapidly respond to damage or infection. Organoid co-cultures with ILCs have already begun shedding light on new epithelial-immune signaling modules in the gut, revealing how different ILC subsets impact intestinal epithelial barrier integrity and regeneration. This protocol will enable further investigations into reciprocal interactions between epithelial and immune cells, which hold the potential to provide new insights into the mechanisms of mucosal homeostasis and inflammation.

This protocol offers detailed instructions for establishing murine small intestine organoids, isolating type-1 innate lymphoid cells from the murine small intestine lamina propria, and establishing 3-dimensional (3D) co-cultures between both cell types to study bi-directional interactions between intestinal epithelial cells and type-1 innate lymphoid cells.

Cocultivo de organoides epiteliales del intestino delgado murino con células linfoides innatas

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate ...

Inmunología e Infección

Mixed Primary Cultures of Murine Small Intestine Intended for the Study of Gut Hormone Secretion and Live Cell Imaging of Enteroendocrine Cells

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal epithelium. Despite their physiological importance, enteroendocrine cells represent only a small fraction of the epithelial cell population and in the past, their characterization has presented a considerable challenge resulting in a reliance on cell line models. Here, we provide a detailed protocol for the isolation and culture of mixed murine small intestinal cells. These primary cultures have been used to identify the signaling pathways underlying the stimulation and inhibition of gut peptide secretion in response to a number of nutrients and neuropeptides as well as pharmacological agents. Furthermore, in combination with the use of transgenic fluorescent reporter mice, we have demonstrated that these primary cultures become a powerful tool for the examination of fluorescently-tagged enteroendocrine cells at the intracellular level, using methods such as patch clamping and single-cell calcium and cAMP-FRET imaging.

This protocol describes the isolation and culture of mixed murine small intestinal cells. These primary intestinal cultures enable the investigation of signaling pathways underlying gut peptide secretion using a number of techniques.

Mezcla de cultivos primarios de murino intestino delgado previstos para el Estudio de Gut Hormone secreción y Imágenes de células vivas de células enteroendocrinas

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal ...

Biología

Rodent Model of Intestinal Ischemia-Reperfusion Injury via Occlusion of the Superior Mesenteric Artery

Intestinal ischemia-reperfusion injury (IRI) is associated with a myriad of conditions in both veterinary and human medicine. Intestinal IRI conditions, such as gastric dilatation volvulus (GDV), mesenteric torsion, and colic, are observed in animals such as dogs and horses. An initial interruption of blood flow causes tissues to become ischemic. Although necessary to salvage viable tissue, subsequent reperfusion can induce further injury. The main mechanism responsible for IRI is free radical formation upon reperfusion and reintroduction of oxygen into damaged tissue, but there are many other components involved. The resulting local and systemic effects often impart a poor prognosis. 
Intestinal IRI has been the subject of extensive research over the past 50 years. An in vivo rodent model in which the base of the superior mesenteric artery (SMA) is temporarily ligated is currently the most common method used to study intestinal IRI. Here, we describe a model of intestinal IRI utilizing isoflurane anesthesia in 21% O2 medical air that yields reproducible injury, as demonstrated by consistent histopathology of the small intestines. Tissue injury was also assessed in the colon, liver, and kidneys.

We describe how to generate a widely used surgical model of intestinal ischemia-reperfusion injury (IRI) in rodents. The procedure involves occlusion of the superior mesenteric artery followed by the restoration of blood flow. This model is useful for studies investigating occlusive causes of intestinal IRI in both veterinary and human medicine.

Modelo en roedor de lesión por isquemia-reperfusión intestinal por oclusión de la arteria mesentérica superior

Intestinal ischemia-reperfusion injury (IRI) is associated with a myriad of conditions in both veterinary and human medicine. Intestinal IRI conditions, ...

<meta charset="utf8"></head><body>Purificación de islotes porcinos por perfusión quirúrgica de páncreas de cerdo

Surgical Perfusion and Isolation of the Porcine Pancreas for Islet Isolation

Pancreatic islet transplantation is an emerging treatment for type I diabetes; however, it is limited by donor matching and availability. Porcine islet xenotransplantation offers a promising alternative to allotransplantation, with the potential for large-scale production of on-demand, functional islets. The yield and viability of isolated islets is highly susceptible to the quality of the donor pancreas and the method of procurement, particularly the duration of warm-ischemia time. To improve organ preservation and subsequent islet yield and viability, we have developed a protocol for surgical perfusion and resection of the porcine pancreas. This protocol employs direct infrarenal aortic cannulation and organ perfusion to both minimize warm-ischemia time and simplify the procedure for operators who do not have extensive surgical expertise. Subsequent arterial perfusion of the pancreas via the aorta flushes stagnant blood from the microvasculature, thereby reducing thrombosis and oxidative damage to the tissue. This manuscript provides a detailed protocol for surgical perfusion and resection of the porcine pancreas, followed by islet isolation and purification.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor destacado: Técnicas y desafíos en la purificación de islotes para xenotrasplantes

This protocol provides a step-by-step guide for the procurement of a porcine pancreas for islet isolation and purification.

Perfusión quirúrgica y aislamiento del páncreas porcino para el aislamiento de islotes

Pancreatic islet transplantation is an emerging treatment for type I diabetes; however, it is limited by donor matching and availability. Porcine islet ...

Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers

Intestinal organoids are increasingly being used to study the gut epithelium for digestive disease modeling, or to investigate interactions with drugs, nutrients, metabolites, pathogens, and the microbiota. Methods to culture intestinal organoids are now available for multiple species, including pigs, which is a species of major interest both as a farm animal and as a translational model for humans, for example, to study zoonotic diseases. Here, we give an in-depth description of a procedure used to culture pig intestinal 3D organoids from frozen epithelial crypts. The protocol describes how to cryopreserve epithelial crypts from the pig intestine and the subsequent procedures to culture 3D intestinal organoids. The main advantages of this method are (i) the temporal dissociation of the isolation of crypts from the culture of 3D organoids, (ii) the preparation of large stocks of cryopreserved crypts derived from multiple intestinal segments and from several animals at once, and thus (iii) the reduction in the need to sample fresh tissues from living animals. We also detail a protocol to establish cell monolayers derived from 3D organoids to allow access to the apical side of epithelial cells, which is the site of interactions with nutrients, microbes, or drugs. Overall, the protocols described here is a useful resource for studying the pig intestinal epithelium in veterinary and biomedical research.

Here, we describe a protocol to culture pig intestinal 3D organoids from cryopreserved epithelial crypts. We also describe a method to establish cell monolayers derived from 3D organoids, allowing access to the apical side of epithelial cells.

Cultivo de organoides 3D intestinales de lechones a partir de criptas epiteliales criopreservadas y establecimiento de monocapas celulares

Intestinal organoids are increasingly being used to study the gut epithelium for digestive disease modeling, or to investigate interactions with drugs, ...

Aislamiento de células madre intestinales y de la cultura en un modelo porcino de isquemia Intestinal pequeño segmentaria

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Ingeniería de tejidos del intestino en un modelo murino

Cultivo tridimensional de criptas colónicas murinas para estudiar la función de las células madre intestinales ex vivo

Modelo murino de isquemia-reperfusión intestinal Lesiones

Cocultivo de organoides epiteliales del intestino delgado murino con células linfoides innatas

Mezcla de cultivos primarios de murino intestino delgado previstos para el Estudio de Gut Hormone secreción y Imágenes de células vivas de células enteroendocrinas

Modelo en roedor de lesión por isquemia-reperfusión intestinal por oclusión de la arteria mesentérica superior

Perfusión quirúrgica y aislamiento del páncreas porcino para el aislamiento de islotes

Perfusión quirúrgica y aislamiento del páncreas porcino para el aislamiento de islotes

Perfusión quirúrgica y aislamiento del páncreas porcino para el aislamiento de islotes

Cultivo de organoides 3D intestinales de lechones a partir de criptas epiteliales criopreservadas y establecimiento de monocapas celulares