Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional del Corazón, Pulmón y la Sangre otorga HL56237, Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales Instituto DK97391-03, la Fundación Nacional de Ciencia (NSF-1227359 y EPS-1003907).

1. La fabricación de dispositivos de microfluidos <ol><li> La fabricación estándar de fotolitografía de un SU-8 maestro molde 50 <ol><li> Limpiar la oblea de silicio antes de spin-coating. Enjuagar una oblea de silicio de 2 pulgadas desnudo con acetona durante 15 min seguido de alcohol isopropílico (IPA) para 15 min. Deshidratar la oblea colocándolo en una placa caliente a 150 ° C durante 1 hr. Después de la deshidratación, enfriar la oblea a temperatura ambiente. </li><li> Spin-capa de la oblea de silicio con SU-8 fotoprotector. Añadir 2 ml SU-8 fotoprotector sobre la oblea. Rampa de la oblea a 500 rpm a 100 rpm de aceleración / s durante 10 s, seguido de 1.000 rpm a 300 rpm / seg aceleración para 30 seg. (Ver Suplementario vídeo 1) </li><li> Pre-hornear la oblea en una placa caliente a 65 ° C durante 10 minutos, luego horneado suave a 95 ° C durante 30 minutos. </li><li> Utilice la exposición UV para transformar el patrón diseñado a partir de una máscara de película a la fotoprotección spin-revestido. Imprimir el patrón sobre una fina película transparente como una máscara de película. Coloque la máscara de la película en la parte superior de lamediante revestimiento por centrifugación fotorresistente y exponer a los rayos UV con una dosis de 300 mJ / cm 2. (Ver Suplementario vídeo 2) Nota: En este protocolo, el patrón de red de microcanales (159 micras de ancho madre canales de derivación en cuatro canales de 100 micras de ancho hija) está diseñado con el software de CAD. El patrón en la película muestra como un campo claro y el resto de la película está cubierta por la tinta de color negro. Debido SU-8 es un fotorresistente negativo, la parte de la resina fotosensible que se expone a los rayos UV se pueden reticular y convertirse en insoluble al disolvente durante el desarrollo del molde (etapa 1.1.6). Después del desarrollo, esta porción insoluble se replicará el patrón de red diseñado y servir como un molde maestro. </li><li> Post-hornear la oblea expuesta sobre una placa caliente a 65 ° C durante 1 min, luego 95 ° C durante 10 min. </li><li> Desarrollar el molde maestro. Uso SU-8 desarrollador como disolvente para eliminar la resina fotosensible no reticulado. Sumergir la oblea en el SU-8 revelador durante 3 minutos y enjuagar con IPApara 1 min. </li><li> Repita este ciclo de desarrollo de 2-3 veces hasta que no hay formación de estrías de color blanco (residuo de resina fotosensible no curada) después del enjuague IPA. secar suavemente la oblea con gas nitrógeno y examinar las pequeñas características del patrón con un microscopio. Repetir los ciclos de desarrollo adicionales si es necesario. </li><li> Duro hornear la oblea en una placa caliente a 150 ° C durante 15 minutos. </li></ol></li><li> La litografía blanda <ol><li> mezclar manualmente las dos partes (base y agente de curado) de polidimetilsiloxano de elastómero (PDMS) en un peso. relación de 10: 1. </li><li> De-gas la mezcla de PDMS con un desecador de vacío conectado con una casa de 15 min. Reparto de la solución de PDMS en el molde maestro fotoprotector. El espesor de la PDMS tiene que ser mayor de 3 mm para proporcionar una sujeción estable de la tubería de entrada / salida. De-gas el PDMS de nuevo durante 15 min, y eliminar las burbujas de aire que quedan con gas nitrógeno, si es necesario. Curar el PDMS fundidos en un horno a 65 ° C durante 3 horas. </li><li> Limpiar la superficie deel cubreobjetos de vidrio con una cinta adhesiva y un limpiador de plasma (tratamiento con plasma de 30 segundos). Spin-capa de PDMS ONU-curado (0,5 ml) sobre el cubreobjetos de vidrio por el aumento gradual a 4.000 rpm a velocidad de aceleración / seg a 500 rpm durante 30 segundos. Curar el cubreobjetos recubierto spin-PDMS en un horno a 65 ° C durante al menos 30 min. </li><li> Cortar y liberar el PDMS curado del molde maestro. A continuación, cree una entrada y una salida con una perforadora 1 mm de diámetro en el extremo distal de los canales madre. </li><li> Unir el dispositivo a la cubreobjetos de vidrio recubiertos-spin PDMS. Oxidar la superficie de los PDMS y el cubreobjetos con un limpiador de plasma para 1 min. Después del tratamiento con plasma de oxígeno, colocar una gota de agua desionizada (agua DI) en la superficie de unión, y colocar las dos piezas juntas. Hornear el dispositivo en un horno a 65 ° C durante 30 min para lograr una unión permanente. </li></ol></li></ol><img alt="Suplementario de vídeo 1" src="/files/ftp_upload/54014/54014movie1.jpg"/&gt; <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54014/Supplemental_video_1.mp4" target="_blank">Suplementario de vídeo 1 (Haga clic derecho para descargar).</a> <img alt="Suplementario Video 2" src="/files/ftp_upload/54014/54014movie2.jpg" /> <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54014/Supplemental_video_2.mp4" target="_blank">Suplementario Video 2 (Haga clic derecho para descargar).</a> 2. endotelial siembra de células y Cultura <ol><li> La esterilización de dispositivos y fibronectina Revestimiento <ol><li> Preservar la propiedad hidrófoba de la superficie de PDMS alrededor de la entrada / salida de la oxidación. Cubrir la superficie de PDMS alrededor de la entrada y la salida con pequeñas tiras de cinta adhesiva para evitar la oxidación. Este procedimiento puede evitar que el agua DI se propague por toda la superficie superior del dispositivo durante la etapa de llenado (2.1.3). </li><li> Se trata el dispositivo de PDMS con plasma de oxígeno for 5 min para cambiar la superficie para que sea hidrófila, de este modo facilitar el flujo de fluido a través del microcanal y prevenir la burbuja atrapando en el procedimiento de llenado (2.1.3). </li><li> Utilice una jeringa con una aguja unida o una pipeta para llenar el dispositivo con agua DI desde la entrada. Continuar el relleno hasta que hay una gota de agua DI (30-50 l) acumulada en la salida. Examine el dispositivo bajo un microscopio para verificar si hay burbujas atrapadas en el interior del microcanal. Eliminar la gotita de agua excesiva en la entrada y la salida con un pañuelo de papel. </li><li> Esterilizar el dispositivo en una placa de Petri con UV durante un mínimo de 3 horas en una campana de bioseguridad laminar. Para evitar la evaporación, cubra la entrada / salida con una fina pieza de PDMS, poner un pañuelo de papel húmedo en el interior del plato, y envolver el plato con Parafilm. </li><li> Recubrir el dispositivo con fibronectina. Enjuague el dispositivo por primera vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS), a continuación, cubrir con 100 mg / ml de fibronectina durante la noche en un refrigerador (4 ° C). Coloque una gota de la solución en la entrada, y luego crear una presión negativa en la salida con un vacío de la casa, una jeringa con una aguja o una pipeta. </li><li> Complete el dispositivo con medios de cultivo celular. Enjuague el dispositivo con PBS manualmente por 3 veces antes de cargar el medio de cultivo celular. Calentar el dispositivo en una incubadora a 37 ° C. </li></ol></li><li> EC Siembra y la perfusión a largo plazo Nota: En comparación con la cultura 2D CE estática convencional, el modelo de red de microvasos in vitro con perfusión continua hizo que el ambiente de cultivo celular más cerca de las condiciones in vivo. El vitro red de microvasos en demostrado en este protocolo se puede mantener hasta dos semanas. La perfusión bien controlada va a reponer los nutrientes de forma continua, eliminar los desechos y evitar el exceso de confluencia de la monocapa CE. Por lo tanto, se puede extender a unos estudios a largo plazo, imitando el entorno celular y hemodinámica bajo diferentes physiological y condiciones patológicas. <ol><li> Mezclar HUVECs primarias en medios de cultivo de HUVEC (MCDB 131) con 8% de dextrano (peso molecular 70.000). El dextrano se utiliza para aumentar la viscosidad de los medios de carga y lograr un mejor resultado la siembra de células. La densidad celular recomendada es de alrededor de 2-4 x 10 6 células / ml. </li><li> Sembrar las células en el dispositivo. Coloque una gota de 10-20 l de células sobre la entrada. Introducir un flujo suave ya sea por la inclinación del dispositivo, o la acción capilar usando una pipeta Pasteur de vidrio en la salida. La clave para el éxito de carga de las células es el control de la velocidad de flujo de menos de 1 mm / s dentro de los canales más pequeños. </li><li> Compruebe la siembra de células. Después de la siembra inicial, incubar el dispositivo durante 15-20 min (atmósfera humidificada de 5% de CO2 a 37 ° C) antes de comprobar el estado de la siembra en el microscopio. Si es necesario, realizar la carga celular adicional para alcanzar una densidad celular deseada. </li><li> Enjuague suavemente el dispositivo con medio de cultivo celular (37° C) para eliminar el dextrano. Cultura del dispositivo en ausencia de flujo para la primera 6 h en una incubadora (5% de CO2 a 37 ° C). </li><li> Configurar la conexión de tubos para la perfusión a largo plazo. Tape el dispositivo en una placa de Petri para evitar el movimiento. Crear pequeños agujeros en la tapa de la placa de Petri para las inserciones de entrada y tubo de salida. Conectar el tubo de entrada a una jeringa con una aguja para la perfusión medios de cultivo celular. Conecte el tubo de salida a un colector de residuos. Nota: Coloque el dispositivo y el colector de residuos en una incubadora de cultivo de células, mientras que la colocación de una bomba de perfusión fuera de la incubadora y conectarlo con el dispositivo por el tubo de entrada de largo. La tasa de perfusión se determina por el diseño experimental. En el presente dispositivo, utilice una velocidad de perfusión de 0,35 l / min y un rango de tensiones de cizallamiento entre 1-2 dinas / cm 2. Bajo esta condición de perfusión, las HUVECs alcanzan la confluencia en aproximadamente 3-4 días. </li></ol></li></ol> 3. ILa tinción mmunofluorescent <ol><li> Fijar el ECs en el dispositivo por perfusión de paraformaldehído al 2% durante 30 min a 4 ° C, seguido de 1x PBS enjuague a temperatura ambiente durante 15 min, y el bloqueo de 30 min 1% de BSA. Utilice una velocidad de perfusión que es el mismo que el utilizado para el cultivo celular. </li><li> Permeabilizar las ECs fijo para la tinción de anticuerpo con 0,1% Triton X-100. Perfundir el dispositivo con Triton de 5-7 minutos a la etiqueta VE-cadherina, y 3 minutos a la etiqueta de F-actina. </li><li> Cargar los anticuerpos en el dispositivo. Perfundir el dispositivo con 1x PBS durante 15 min para lavar las soluciones anteriores. cargar manualmente el anticuerpo primario contra cadherina VE (anti-cabra) en el dispositivo a la concentración de 2 mg / ml (el volumen total es de 20 a 50 l). Mantenga el dispositivo en un refrigerador a 4 ° C durante la noche. Perfundir el anticuerpo secundario (de burro anti-cabra) por una bomba de jeringa a una concentración de 7 g / ml durante 45-60 min. </li><li> Etiqueta CE F-actina con faloidina. Perfundir el dispositivo con PBS 1x for 15 min antes de cargar manualmente faloidina (10 mg / ml) durante 7-10 min. </li><li> Etiqueta núcleos CE (véase la Lista de Materiales). </li><li> Enjuague el dispositivo con 1x PBS, y mantenerla a 4 ° C hasta que la imagen. </li></ol> 4. Obtención de imágenes de fluorescencia endotelial [Ca2 +] i <ol><li> Perfundir el dispositivo con la albúmina (10 mg / ml) la solución de -Ringer durante 15 min a 37 ° C. Utilizar la misma tasa de perfusión que el utilizado para el cultivo celular. Las concentraciones de todos los componentes de la solución de albúmina-Ringer se describen en la Lista de materiales. </li><li> Establecer un sistema confocal para EC [Ca2 +] i la formación de imágenes con fluo-4 PM. Utilice un sistema de microscopio confocal para obtener imágenes de Ca 2+. Utilizar un láser de argón (488 nm) para la excitación y ajustar la banda de emisión como 510-530 nm. Recoger las imágenes con un objetivo 25X (inmersión en agua, NA: 0,95) a 512 x 512 formato de exploración. Use un z-escalón de 2 my un intervalo de exploración para cada pila de imagos de 20 seg. </li><li> Perfundir el dispositivo con fluo-4 de AM (5 M) durante 40 minutos a 37 ° C, y luego lavar el lumen fluo-4 AM con la solución de albúmina-Ringer. </li><li> Adquirir imágenes de microvasos fluo-4 cargado. Recoger las imágenes de línea de base durante 10 minutos. Perfundir el dispositivo con ATP (10 mM) y registrar los cambios de intensidad de fluorescencia (FI) para 20 min. </li></ol> 5. Obtención de imágenes de fluorescencia producción de óxido nítrico <ol><li> Perfundir el dispositivo con la solución de albúmina-Ringer durante 15 min. Utilice una velocidad de perfusión que es el mismo que el utilizado para el cultivo celular. </li><li> Configurar el sistema de imágenes de fluorescencia para medir la producción de óxido nítrico inducida por ATP. Use un microscopio equipado con una cámara CCD digital de 12 bits y un obturador controlado por ordenador para la medición de óxido nítrico. Utilice una lámpara de xenón de 75 W como fuente de luz. Nota: Seleccionar la excitación y emisión de longitudes de onda para DAF-2 DA por un filtro de interferencia (480/40 nm) y un espejo dicroico(505 nm) con una barrera de paso de banda (535/50 nm). Use un lente objetivo de 20X (NA: 0,75) para recoger las imágenes. Para minimizar photobleaching, coloque un filtro de densidad neutra (0,5 N) delante del filtro de interferencia y limitar el tiempo de exposición a 0,12 seg. </li><li> Cargar las células con DAF-2 DA (5 M). Perfundir el dispositivo con DAF-2 DA durante aproximadamente 35-40 minutos a 37 ° C. Grabar la línea de base de DAF-2 intensidad de fluorescencia (FI DAF) después de la carga inicial. Nota: DAF-2 DA está continuamente presente en el perfundido durante todo el experimento 7. </li><li> Recoger DAF-2 imágenes. Grabar la línea de base de FI DAF durante 5 min. Perfundir el dispositivo con ATP (10 mM) y recoger las imágenes durante 30 minutos con intervalos de 1 min. Recoge todas las imágenes de un mismo grupo de células en el mismo plano focal. </li></ol> Análisis 6. Datos <ol><li> seleccionar manualmente la región de interés (ROI) de las imágenes recogidas a nivel de células individuales. CadaRetorno de la inversión cubre la superficie de una célula individual que puede ser indicada por el contorno de fluorescencia. </li><li> Restar la fluorescencia de fondo y calcular la media de cada FI ROI. </li><li> Medir los cambios inducidos por el ATP en CE [Ca2 +] i y la producción de NO. Cuantificar los cambios inducidos por el ATP en CE [Ca2 +] i mediante el cálculo de los cambios en el Fluo-4 FI (FI / FI 0 * 100, donde 0 es la FI FI basal media durante la perfusión de albúmina-Ringer antes de añadir ATP) menos la medida fondo. NO cuantificar la tasa de producción mediante la realización de la primera conversión diferencial de la FI DAF con el tiempo. Nota: El curso temporal de FI DAF representa una producción de NO acumulado con el tiempo. Por lo tanto, NO tasa de producción se calcula en base al perfil de FI DAF bajo tanto basal como estimulada condiciones ATP. Los detalles de análisis de datos y procedimientos experimentales se han descrito en una publicación anterior 7. </li></ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origins+and+the+future+of+microfluidics.">The origins and the future of microfluidics.</a> Nature. 442, 368-373 (2006).</li><li>Lamberti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinspired+microfluidic+assay+for+in+vitro+modeling+of+leukocyte-endothelium+interactions.">Bioinspired microfluidic assay for in vitro modeling of leukocyte-endothelium interactions.</a> Anal Chem. 86, 8344-8351 (2014).</li><li>Myers, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelialized+microfluidics+for+studying+microvascular+interactions+in+hematologic+diseases.">Endothelialized microfluidics for studying microvascular interactions in hematologic diseases.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Smith, A. M., Prabhakarpandian, B., Pant, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Shear+Adhesion+Map+Using+SynVivo+Synthetic+Microvascular+Networks.">Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks.</a> Jove-J Vis Exp. , e51025 (2014).</li><li>Booth, R., Kim, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+microfluidic+in+vitro+model+of+the+blood-brain+barrier+(iBBB).">Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (iBBB).</a> Lab on a Chip. 12, 5282-5282 (2012).</li><li>Shao, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+microfluidic+chip+for+endothelial+cells+culture+and+analysis+exposed+to+a+pulsatile+and+oscillatory+shear+stress.">Integrated microfluidic chip for endothelial cells culture and analysis exposed to a pulsatile and oscillatory shear stress.</a> Lab on a Chip. 9, 3118-3125 (2009).</li><li>Yeon, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+permeability+assay+system+in+a+microfluidic+device+mimicking+cerebral+vasculatures.">Reliable permeability assay system in a microfluidic device mimicking cerebral vasculatures.</a> Biomed Microdevices. 14, 1141-1148 (2012).</li><li>Golden, A. P., Tien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+microfluidic+hydrogels+using+molded+gelatin+as+a+sacrificial+element.">Fabrication of microfluidic hydrogels using molded gelatin as a sacrificial element.</a> Lab Chip. 7, 720-725 (2007).</li><li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+microvessels+for+the+study+of+angiogenesis+and+thrombosis.">In vitro microvessels for the study of angiogenesis and thrombosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 9342-9347 (2012).</li><li>Baker, B. M., Trappmann, B., Stapleton, S. C., Toro, E., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+embedded+within+extracellular+matrix+to+define+vascular+architectures+and+pattern+diffusive+gradients.">Microfluidics embedded within extracellular matrix to define vascular architectures and pattern diffusive gradients.</a> Lab Chip. 13, 3246-3252 (2013).</li></ol>

Los autores no tienen intereses en competencia o intereses en conflicto a revelar.

<html> En este artículo, se presentan los protocolos detallados para el desarrollo de la red de microvasos culta, la caracterización de los cruces de la CE y el citoesqueleto de actina F de distribución, y las mediciones cuantitativas de la CE [Ca2 +] i y la producción de NO usando un dispositivo de microfluidos. El dispositivo de microfluidos perfundido proporciona un modelo in vitro que permite un cierre de simulación de las geometrías microvasculares in vivo y las condicio...

Las células endoteliales (EC) que recubren las paredes de los vasos sanguíneos in vivo están constantemente expuestos a fluir, pero ECs cultivadas a menudo se cultivan en condiciones estáticas y exhiben un fenotipo pro-inflamatoria 1,2. La tecnología microfluídica permite un fluido controlada con precisión a través de una microescala geométricamente limitados (sub-milímetro) los canales 3, lo que proporciona la oportunidad para que las células cultivadas, especialmente para ECs vascular, creciendo bajo condiciones de flujo deseadas. Estas características hacen que las condiciones de cultivo celular in vivo más cerca de que los cultivos convencionales, estáticas 2D celulares. Son extremadamente importante cuando los dispositivos de microfluidos se utilizan para modelar los diferentes tipos de vasculatures y para estudiar las respuestas de las CE a estímulos mecánicos y / o químicos. A pesar de las ventajas demostradas por la red de microcanales a través de un cultivo de células estático, la adaptación y aplicación de la microfluídica en la f biomédicaield siguen siendo limitados. Informado por una revisión reciente, la mayoría de las publicaciones de este campo (85%) se encuentran todavía en revistas de ingeniería 4. El rendimiento de los dispositivos de microfluidos no ha sido lo suficientemente convincente como para la mayoría de los biólogos para pasar de las técnicas actuales, tales como el ensayo Transwell y la macro-escala de diapositivas placa de cultivo / vidrio para este dispositivo miniaturizado. Microfluídica es un campo multidisciplinario, que requiere la colaboración interdisciplinaria para progresar en este campo. El objetivo de este artículo técnico es reducir las brechas de conocimiento entre disciplinas y realizar los procedimientos de fabricación comprensible por los biólogos, mientras que proporciona la aplicación biológica y validación funcional de los microvasos de microfluidos. Los protocolos experimentales visualizados incluyen la fabricación de ambos dispositivos de microfluidos y sus utilidades biológicas, lo que supone una estrecha colaboración entre los ingenieros y biólogos. Recientemente hemos informado de algunosaplicaciones biológicas que utilizan la red de microvasos in vitro con dispositivo de microfluidos 5. Con el fin de diseñar apropiadamente las dimensiones de la red de microcanales y aplicar la tensión de corte deseado, un modelo numérico fue construido con el software de dinámica de fluidos computacional para estimar estrechamente el perfil de flujo. Las células primarias humanas endoteliales de vena umbilical (HUVEC) que fueron sembradas en los microcanales alcanzaron la confluencia, es decir, cubiertas las superficies interiores enteras del microcanal, en 3-4 días con perfusión continua. La formación de la barrera adecuada se demostró por tinción VE-cadherina y en comparación con los formados en condiciones de cultivo de células estáticos y en microvasos intactas. Mediante la aplicación de los protocolos experimentales desarrolladas en microvasos intactas perfundidos individualmente 6-8, que mide cuantitativamente los cambios en la CE [Ca2 +] i y el óxido nítrico (NO) en respuesta a la adenosina trifosfato (ATP) con fluorescente inindicadores y confocal y microscopía de fluorescencia convencional. Los aumentos inducidos por agonistas en CE [Ca2 +] i y la producción de NO se han reportado como señales intracelulares necesarias para inflamatorias mediador aumentos inducidos en la permeabilidad microvascular 6-15. Aunque algunos estudios anteriores mostraron imágenes de dispositivos de microfluidos DAF-2 DA cargados 16,17, resolución y los datos apropiados análisis todavía no había alcanzado 18. Para nuestro conocimiento, este estudio demuestra las primeras mediciones cuantitativas de cambio dinámico inducida por el agonista en endotelial i y la producción de NO utilizando microfluidos sistema basado en [Ca 2 +]. Técnicas de microfabricación tienen la flexibilidad para fabricar microcanales a unas pocas micras y permitir el desarrollo de patrones complejos para imitar las geometrías de la microvasculatura en vivo. Aquí presentamos una red de microcanales típico con tres niveles de ramificación. Estala red se fabrica mediante la combinación de fotolitografía que se realiza en una sala limpia de microfabricación y litografía blanda.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1058">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">ATP</td>
			<td style="width:247px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:327px;">A2383</td>
			<td style="width:183px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Biopsy punch</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>33-31 AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine Albumin</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>810014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine Brain Extract (BBE)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-4098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cover-slip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-542C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DAF-2 DA</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>251505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DRAQ5 (nuclei staining)&#160;</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E2759-15MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fibronectin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHE0023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluo-4 AM</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>F-14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gelatin from porcine skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1890-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gentamicin (50 mg/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750-078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass coverslip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-548B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass Pasteur pippette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3393-10KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES Buffered Saline Solution</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-2517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isopropyl alcohol (IPA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mammalian Ringer Solution Ingredient</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl (132 mM)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S671-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCL (4.6 mM)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">CaCl2 &#183; 2H2O (2.0 mM)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">MgSO4 &#183;7H2O (1.2 mM)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M63-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucose(5.5 mM)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP350-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">NaHCO3 (5.0 mM)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S233-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hepes Salt (9.1 mM)</td>
			<td>Research Organics</td>
			<td>6007H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hepes Acid (10.9 mM)</td>
			<td>Research Organics</td>
			<td>6003H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MCDB 131 Culture Medium</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>10372-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phalloidin (F-actin staining)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14040-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scalpel</td>
			<td>Exel Int</td>
			<td>29552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scotch tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>34-8711-3070-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Silicon wafer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SU-8 photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>SU-8 2050 Y111072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SU-8 developer</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y020100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">tissue culture flasks</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z707503-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Chemical Book</td>
			<td>T6878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin Neutralizer solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>R-002-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin/EDTA Solution (TE)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>R-001-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>PTFE microbore tubing, 0.012&#34; ID x 0.030&#34; OD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">VE-cadherin</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-6458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:247px;">Company</td>
			<td style="width:327px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:183px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Biosafety Laminar hood</td>
			<td>NuAire</td>
			<td>NU-425 Class II, Type A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CCD camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>ORCA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Desiccator</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>F42022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hotplate</td>
			<td>Wenesco</td>
			<td>HP-1212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Incubator</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td>3110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isotemp oven</td>
			<td>Barnstead</td>
			<td>3608-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lithography bench</td>
			<td>Karl Suss</td>
			<td>MA6 Contact Lithography</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Optical microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>L200 ND &#38; Diaphod 300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Shutter for the CCD camera</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>Lambda 10-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plasma cleaner</td>
			<td>PVA TePla/Harrick plasma</td>
			<td>M4L/PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spin coater</td>
			<td>Brewer Science</td>
			<td>Cee 200X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe pump system</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>703005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name of Software</td>
			<td style="width:247px;">Company</td>
			<td style="width:327px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:183px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CAD software</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td>AutoCAD 2015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CFD simulation software</td>
			<td>COMSOL</td>
			<td>COMSOL Multiphysics 4.0.0.982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Images acquire and analyse for NO production&#160;</td>
			<td>Universal Imaging</td>
			<td>Metafluor</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development and characterization of in vitro microvessel network and quantitative measurements of endothelial [ca2+]i and nitric oxide production

Las células endoteliales (EC) que recubren las paredes de los vasos sanguíneos in vivo están constantemente expuestos a fluir, pero ECs cultivadas a menudo se cultivan en condiciones estáticas y exhiben un fenotipo pro-inflamatoria. Aunque el desarrollo de dispositivos de microfluidos ha sido abrazado por los ingenieros de más de dos décadas, sus aplicaciones biológicas siguen siendo limitados. Un modelo in vitro de microvasos fisiológicamente más relevantes en validada por aplicaciones biológicas es importante para avanzar en el campo y salvar las diferencias entre in vivo e in vitro estudios. A continuación, presentamos los procedimientos detallados para el desarrollo de la red de microvasos cultivan utilizando un dispositivo de microfluidos con una capacidad de perfusión a largo plazo. También demuestran sus aplicaciones para mediciones cuantitativas de los cambios inducidos por agonistas en EC I y el óxido nítrico (NO) [Ca 2+] en tiempo real utilizando confocal y microscopía de fluorescencia convencional. La red de microvasos formadotrabajo con perfusión continua mostró uniones bien desarrollados entre los CE. VE-cadherina distribución estaba más cerca de la observada en los microvasos intacto que monocapas CE estáticamente cultivadas. ATP-indujo aumentos transitorios en la CE [Ca2 +] i y la producción de NO se midió cuantitativamente en los niveles de células individuales, que haya validado la funcionalidad de los microvasos cultivadas. Este dispositivo de microfluidos permite ECs para crecer bajo un bien controlado, el flujo fisiológicamente relevante, lo que hace que el entorno de cultivo celular más cercano a in vivo que el de los cultivos 2D convencionales, estáticas. El diseño de la red de microcanales es altamente versátil, y el proceso de fabricación es simple y repetible. El dispositivo se puede integrar fácilmente en el sistema microscópico confocal o convencional que permite imágenes de alta resolución. Lo más importante, ya que la red de microvasos cultivadas puede estar formado por ECs humanos primarios, este enfoque servirá como una herramienta útil para investigar cómopatológicamente componentes sanguíneos alterados a partir de muestras de pacientes humanos afectan a los EC y dar una idea de los problemas clínicos. También puede ser desarrollado como una plataforma para la detección de drogas.

Esta sección muestra algunos de los resultados obtenidos con la red de microvasos cultivaron desarrollado con este protocolo. El patrón de microcanales es una red de ramificación de tres niveles (Figura 1A). En este diseño, unas 159 micras de ancho ramas del canal madre en dos canales de 126 micras de ancho, y las ramas de nuevo en cuatro canales de 100 micras de ancho hija. Una simulación numérica 3D se realizó para estimar la distribución de esfuerzo cortante b...

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Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.

Desarrollo y caracterización de<em&gt; In Vitro</em&gt; Red de microvasos y mediciones cuantitativas de endotelial [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; Y la producción de óxido nítrico

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

development-characterization-vitro-microvessel-network-quantitative

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

8.5K vistas.  College of Medicine, Penn State University. Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.

Video: Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A hemacytometer is a thick glass slide with a central area designed as a counting chamber. Cell suspension is applied to a defined area and counted so cell density can be calculated. 

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. In this video, we demonstrate how cells are counted using a hemacytometer.

Contar y determinar la viabilidad de las células cultivadas

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A ...

Investigación

Biología

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in unregulated concentrations are detrimental to cell viability1, 2. While living systems have evolved with endogenous and dietary antioxidant defense mechanisms to regulate ROS generation, ROS are produced continuously as natural by-products of normal metabolism of oxygen and can cause oxidative damage to biomolecules resulting in loss of protein function, DNA cleavage, or lipid peroxidation3, and ultimately to oxidative stress leading to cell injury or death4. 
Superoxide radical anion (O2&bull;-) is the major precursor of some of the most highly oxidizing species known to exist in biological systems such as peroxynitrite and hydroxyl radical. The generation of O2&bull;- signals the first sign of oxidative burst, and therefore, its detection and/or sequestration in biological systems is important. In this demonstration, O2&bull;- was generated from polymorphonuclear neutrophils (PMNs). Through chemotactic stimulation with phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA), PMN generates O2&bull;- via activation of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase5. 
Nitric oxide (NO) synthase which comes in three isoforms, as inducible-, neuronal- and endothelial-NOS, or iNOS, nNOS or eNOS, respectively, catalyzes the conversion of L- arginine to L-citrulline, using NADPH to produce NO6. Here, we generated NO from endothelial cells. Under oxidative stress conditions, eNOS for example can switch from producing NO to O2&bull;- in a process called uncoupling, which is believed to be caused by oxidation of heme7 or the co-factor, tetrahydrobiopterin (BH4)8.
There are only few reliable methods for the detection of free radicals in biological systems but are limited by specificity and sensitivity. Spin trapping is commonly used for the identification of free radicals and involves the addition reaction of a radical to a spin trap forming a persistent spin adduct which can be detected by electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy. The various radical adducts exhibit distinctive spectrum which can be used to identify the radicals being generated and can provide a wealth of information about the nature and kinetics of radical production9.
The cyclic nitrones, 5,5-dimethyl-pyrroline-N-oxide, DMPO10, the phosphoryl-substituted DEPMPO11, and the ester-substituted, EMPO12 and BMPO13, have been widely employed as spin traps--the latter spin traps exhibiting longer half-lives for O2&bull;- adduct. Iron (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe(MGD)2 is commonly used to trap NO due to high rate of adduct formation and the high stability of the spin adduct14.

Electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy was employed to detect nitric oxide from bovine aortic endothelial cells and superoxide radical anion from human neutrophils using iron (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe(MGD)2 and 5,5-dimethyl-1-pyroroline-N-oxide, DMPO, respectively.

La detección de óxido nítrico y el radical anión superóxido por espectroscopía de resonancia paramagnética de electrones de las células utilizando atrapadores

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small molecule studies and drug development 4. Many epigenetic regulators have only recently been discovered and are still in the process of being classified. Among these enzymes are lysine demethylases which remove methyl groups from lysines on histones and other proteins. Due to the novel nature of this class of enzymes, few assays have been developed to study their activity. This has been a road block to both the classification and high throughput study of histone demethylases. Currently, very few demethylase assays exist. Those that do exist tend to be qualitative in nature and cannot simultaneously discern between the different lysine methylation states (un-, mono-, di- and tri-). Mass spectrometry is commonly used to determine demethylase activity but current mass spectrometric assays do not address whether differentially methylated peptides ionize differently. Differential ionization of methylated peptides makes comparing methylation states difficult and certainly not quantitative (Figure 1A). Thus available assays are not optimized for the comprehensive analysis of demethylase activity.
Here we describe a method called MassSQUIRM (mass spectrometric quantitation using isotopic reductive methylation) that is based on reductive methylation of amine groups with deuterated formaldehyde to force all lysines to be di-methylated, thus making them essentially the same chemical species and therefore ionize the same (Figure 1B). The only chemical difference following the reductive methylation is hydrogen and deuterium, which does not affect MALDI ionization efficiencies. The MassSQUIRM assay is specific for demethylase reaction products with un-, mono- or di-methylated lysines. The assay is also applicable to lysine methyltransferases giving the same reaction products. Here, we use a combination of reductive methylation chemistry and MALDI mass spectrometry to measure the activity of LSD1, a lysine demethylase capable of removing di- and mono-methyl groups, on a synthetic peptide substrate 5. This assay is simple and easily amenable to any lab with access to a MALDI mass spectrometer in lab or through a proteomics facility. The assay has ~8-fold dynamic range and is readily scalable to plate format 5.

We present a method for using MALDI mass spectrometry and reductive methylation chemistry to quantify changes in lysine methylation.

Aplicación de MassSQUIRM para mediciones cuantitativas de la actividad desmetilasa Lisina

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

Análisis de estrés oxidativo en embriones de pez cebra

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

Reconstitución funcional y la actividad del canal Las mediciones de Purificada Wildtype y mutante CFTR Proteína

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on changes in intracellular calcium ([Ca2+]i) and nitric oxide (NO). In order to understand how [Ca2+]i, NO and downstream molecules are handled by a blood vessel in response to vasoconstrictors and vasodilators, we developed a novel technique that applies calcium-labeling (or NO-labeling) dyes with two photon microscopy to measure calcium handling (or NO production) in isolated blood vessels. Described here is a detailed step-by-step procedure that demonstrates how to isolate an aorta from a rat, label calcium or NO within the endothelial or smooth muscle cells, and image calcium transients (or NO production) using a two photon microscope following physiological or pharmacological stimuli. The benefits of using the method are multi-fold: 1) it is possible to simultaneously measure calcium transients in both endothelial cells and smooth muscle cells in response to different stimuli; 2) it allows one to image endothelial cells and smooth muscle cells in their native setting; 3) this method is very sensitive to intracellular calcium or NO changes and generates high resolution images for precise measurements; and 4) described approach can be applied to the measurement of other molecules, such as reactive oxygen species. In summary, application of two photon laser emission microscopy to monitor calcium transients and NO production in the endothelial and smooth muscle cells of an isolated blood vessel has provided high quality quantitative data and promoted our understanding of the mechanisms regulating vascular function.

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.

De dos fotones de imágenes de Ca intracelular<sup&gt; 2 +</sup&gt; Manejo y producción de óxido nítrico en el endotelio y las células del músculo liso de la aorta de rata aislada

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This occurs when endothelial cells, which line blood vessels, become adhesive to circulating immune cells such as monocytes. In vitro measurement of this adhesiveness has until now been done by quantifying the total number of monocytes that adhere to an endothelial layer either as a direct count or by indirect measurement of the fluorescence of adherent monocytes. While such measurements do indicate the average adhesiveness of the endothelial cell population, they are confounded by a number of factors, such as cell number, and do not reveal the proportion of endothelial cells that are actually adhesive. Here we describe and demonstrate a method which allows the enumeration of adhesive cells within a tested population of endothelial monolayer. Endothelial cells are grown on glass coverslips and following desired treatment are challenged with monocytes (that may be fluorescently labeled). After incubation, a rinsing procedure, involving multiple rounds of immersion and draining, the cells are fixed. Adhesive endothelial cells, which are surrounded by monocytes are readily identified and enumerated, giving an adhesion index that reveals the actual proportion of endothelial cells within the population that are adhesive.

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

La cuantificación de la adhesividad de la célula endotelial<em&gt; In Vitro</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular physiology. Dysfunctional eNOS such as uncoupling of eNOS leads to decrease in NO bioavailability and increase in superoxide anion (O2.&#8722;) production, and in turn promotes cardiovascular diseases. Therefore, appropriate measurement of NO and O2.&#8722; levels in the endothelial cells are pivotal for research on cardiovascular diseases and complications. Because of the extremely labile nature of NO and O2.&#8722;, it is difficult to measure NO and O2.&#8722; directly in a blood vessel. Numerous methods have been developed to measure NO and O2.&#8722; production. It is, however, either insensitive, or non-specific, or technically demanding and requires special equipment. Here we describe an adaption of the fluorescence dye method for en face simultaneous detection and visualization of intracellular NO and O2.&#8722; using the cell permeable diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE), respectively, in intact aortas of an obesity mouse model induced by high-fat-diet feeding. We could demonstrate decreased intracellular NO and enhanced O2.&#8722; levels in the freshly isolated intact aortas of obesity mouse as compared to the control lean mouse. We demonstrate that this method is an easy technique for direct detection and visualization of NO and O2.&#8722; in the intact blood vessels and can be widely applied for investigation of endothelial (dys)function under (physio)pathological conditions.

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

In this article we describe an adapted relatively easy method using the fluorescence dye diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE) for en face simultaneous detection and visualization of intracellular nitric oxide (NO) and superoxide anion (O2.&#8722;) respectively, in freshly isolated intact aortas of an obesity mouse model.

En Detección de la cara del óxido nítrico y superóxido en la capa endotelial de las arterias intactas

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as well as pathological changes in endothelial phenotype and gene expression. In particular, maladaptive effects of periodic, unidirectional flow induced shear stress can trigger a variety of effects on several vascular cell types, particularly endothelial cells. While by now endothelial cells from diverse anatomic origins have been cultured, in-depth analyses of their responses to fluid shear have been hampered by the relative complexity of shear models (e.g., parallel plate flow chamber, cone and plate flow model). While these all represent excellent approaches, such models are technically complicated and suffer from drawbacks including relatively lengthy and complex setup time, low surface areas, requirements for pumps and pressurization often requiring sealants and gaskets, creating challenges to both maintenance of sterility and an inability to run multiple experiments. However, if higher throughput models of flow and shear were available, greater progress on vascular endothelial shear responses, particularly periodic shear research at the molecular level, might be more rapidly advanced. Here, we describe the construction and use of shear rings: a novel, simple-to-assemble, and inexpensive tissue culture model with a relatively large surface area that easily allows for a high number of experimental replicates in unidirectional, periodic shear stress studies on endothelial cells.

Different levels and patterns of fluid shear are known to modulate endothelial gene expression, phenotype and susceptibility to disease. We discuss the assembly and use of 'shear rings': a model that produces unidirectional, periodic shear stress patterns. Shear rings are simple to assemble, economical and can produce high cell yields.

La Asamblea y la Aplicación de &#39;Shear Anillos&#39;: A Novel endotelial Modelo de Orbital, unidireccional y periódica flujo de fluido y la tensión de cizallamiento

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as ...

Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method

Nitric oxide (NO) is one of the main regulator molecules in vascular homeostasis and also a neurotransmitter. Enzymatically produced NO is oxidized into nitrite and nitrate by interactions with various oxy-heme proteins and other still not well known pathways. The reverse process, reduction of nitrite and nitrate into NO had been discovered in mammals in the last decade and it is gaining attention as one of the possible pathways to either prevent or ease a whole range of cardiovascular, metabolic and muscular disorders that are thought to be associated with decreased levels of NO. It is therefore important to estimate the amount of NO and its metabolites in different body compartments &#8212; blood, body fluids and the various tissues. Blood, due to its easy accessibility, is the preferred compartment used for estimation of NO metabolites. Due to its short lifetime (few milliseconds) and low sub-nanomolar concentration, direct reliable measurements of blood NO in vivo present great technical difficulties. Thus NO availability is usually estimated based on the amount of its oxidation products, nitrite and nitrate. These two metabolites are always measured separately. There are several well established methods to determine their concentrations in biological fluids and tissues. Here we present a protocol for chemiluminescence method (CL), based on spectrophotometrical detection of NO after nitrite or nitrate reduction by tri-iodide or vanadium(III) chloride solutions, respectively. The sensitivity for nitrite and nitrate detection is in low nanomolar range, which sets CL as the most sensitive method currently available to determine changes in NO metabolic pathways. We explain in detail how to prepare samples from biological fluids and tissues in order to preserve original amounts of nitrite and nitrate present at the time of collection and how to determine their respective amounts in samples. Limitations of the CL technique are also explained.

Nitric oxide (NO) is an important signaling molecule in vascular homeostasis. NO production in vivo is too low for direct measurement. Chemiluminescence provides useful insight into NO cycle via measuring its precursors and oxidation products, nitrite and nitrate. Nitrite / nitrate determination in body tissues and fluids is explained.

La medición de nitritos y nitratos, los metabolitos en el Oxido Nítrico, en Materiales Biológicos utilizando el método de quimioluminiscencia

Nitric oxide (NO) is one of the main regulator molecules in vascular homeostasis and also a neurotransmitter. Enzymatically produced NO is oxidized into ...

Desarrollo y caracterización de

Resumen

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